微生物檢驗細菌耐藥檢驗

第十一章細菌耐藥性檢測1整理課件1.葡萄球菌屬的天然耐藥對第一代喹諾酮類天然耐藥。腐生葡萄球菌對磷霉素天然耐藥。耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌對所有β-內酰胺類抗菌藥物耐藥。包括青霉素類、頭孢菌素類、含酶抑制劑的復合制劑、碳青霉烯類、氨曲南、頭霉素類。2整理課件2.腸球菌的天然耐藥對一、二、三、四頭孢菌素、克林霉素、磺胺類、氨基糖苷類〔高濃度除外〕天然耐藥?？蛇x范圍：青霉素、氨芐西林、萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺、頭孢硫脒等。3整理課件3.鏈球菌天然耐藥肺炎鏈球菌對第一代喹諾酮類藥物耐藥，并對諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星敏感性低。鏈球菌對氨基糖苷類天然耐藥或對水平耐藥。4.李斯特菌天然耐藥對磺胺類、桿菌肽、多粘菌素、頭孢菌素類天然耐藥。4整理課件細菌的常見耐藥機制細菌耐藥機制主要有四種：產生一種或多種水解酶、鈍化酶和修飾酶；抗生素作用的靶位改變，包括青霉素結合蛋白位點、DNA解旋酶、DNA拓撲異構酶Ⅳ的改變等；細菌膜的通透性下降，包括細菌生物被膜的形成和通道蛋白喪失；細菌主動外排系統(tǒng)的過度表達。在上述耐藥機制中，第一、二種耐藥機制具有專一性，第三、四種耐藥機制不具有專一性。5整理課件β-內酰胺酶

β內酰胺酶是一類水解青霉素、頭孢菌素類抗生素的滅活酶；該酶位于革蘭陽性球菌菌體外，革蘭陰性桿菌間質中；檢測方法有微生物培養(yǎng)法、碘－淀粉法、頭孢硝噻吩紙片法。其中頭孢硝噻吩紙片法因為簡單、方便、快速，應用于臨床檢測。6整理課件超廣譜β-內酰胺酶〔ESBLs〕ESBLs是指由質粒介導的能水解青霉素類、頭孢菌素類和單環(huán)

內酰胺類氨曲南的一類酶；ESBLs不能水解頭霉素類和碳青霉烯類藥物，能被克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦等

內酰胺酶抑制劑所抑制；ESBLs主要見于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，此外也見于腸桿菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬、沙雷菌屬等其他腸桿菌科細菌、不動桿菌、銅綠假單胞菌。7整理課件超廣譜β-內酰胺酶〔ESBLs〕稀釋法，出現(xiàn)以下一種情況即可疑心該菌株產生ESBL：頭孢他啶或頭孢噻肟或頭孢曲松或氨曲南MIC≥2mg/mL或頭孢泊肟MIC≥8mg/mL8整理課件超廣譜β-內酰胺酶〔ESBLs〕紙片法，出現(xiàn)以下一種情況即可疑心該菌株產生ESBL〔篩選陽性〕：頭孢泊肟≤17mm頭孢他啶≤22mm頭孢噻肟≤27mm頭孢曲松≤25mm氨曲南≤27mm9整理課件超廣譜β-內酰胺酶〔ESBLs〕紙片法〔表型確認試驗〕頭孢他啶和頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟和頭孢噻肟/克拉維酸。任一復方制劑的抑菌圈直徑與相應單藥抑菌圈直徑相差≥5mm時，即可判斷該菌產ESBL。10整理課件超廣譜β-內酰胺酶〔ESBLs〕稀釋法〔表型確認試驗〕頭孢他啶和頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟和頭孢噻肟/克拉維酸。任何一組酶抑制劑復方制劑的MIC值比相應單藥的MIC降低3個稀釋度者即可判定該菌為產ESBL菌株。11整理課件AmpC酶的特征AmpC酶是在革蘭陰性菌中發(fā)現(xiàn)的由染色體或質粒介導的水解頭孢菌素的Ⅰ型β內酰胺酶，可分為誘導酶和非誘導酶。與ESBLs不同的是，AmpC酶對三代頭孢菌素耐藥但對四代頭孢菌素敏感且不被酶抑制劑克拉維酸所抑制，但其酶活性可被氯唑西林和硼酸抑制。12整理課件AmpC酶的檢測方法頭孢西丁三維試驗是檢測AmpC酶的經典方法；除此之外，還有以硼酸化合物為抑制劑檢測肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌的AmpC酶、AmpCDisk、頭孢西丁瓊脂根底法等。13整理課件碳青霉烯酶碳青霉烯酶可以定義為具有水解碳青霉烯類抗生素活性的β-內酰胺酶，主要分布于β-內酰胺酶A、B、D類中。根據水解機制中作用位點的不同可以將碳青霉烯酶分為兩大類：一類稱為金屬碳青霉烯酶，這類酶以金屬鋅離子為活性作用位點，可以被EDTA抑制，屬于B類β-內酰胺酶；另一類以絲氨酸〔Ser〕為酶的活性作用位點，可以被酶抑制劑克拉維酸和他唑巴坦所抑制，屬于A、D類β-內酰胺酶。14整理課件耐甲氧西林金黃色葡萄球菌〔MRSA〕攜帶SCCmec基因盒。SCCmec基因盒中的MecA基因編碼修飾的青霉素結合蛋白PBP2a，這種蛋白對甲氧西林和其他的β-內酰胺類抗生素親和力下降，從而導致對這些抗生素的耐藥。SCCmec主要由mec復合物和ccr復合物兩局部組成。根據不同mec復合物和ccr復合物的組合，可以將SCCmec分成不同的型別，目前已發(fā)現(xiàn)8種SCCmec型。耐甲氧西林葡萄球菌15整理課件耐甲氧西林葡萄球菌的檢測MRSA的檢測方法有頭孢西丁紙片擴散法、苯唑西林瓊脂稀釋法、乳膠凝膠試驗檢測PBP2a、mecA基因測定及MRSA顯色培養(yǎng)基。頭孢西丁紙片法、苯唑西林瓊脂稀釋法是目前檢測耐甲氧西林葡萄球菌最常用篩選方法。對于金黃色葡萄球菌，MRSA的檢測可以使用苯唑西林紙片，但對于凝固酶陰性葡萄球菌那么不能使用苯唑西林紙片。16整理課件甲氧西林耐藥的葡萄球菌〔MRS〕MRS檢測藥物紙片法稀釋法金黃色葡萄球菌1mg苯唑西林√√路鄧葡萄球菌1mg苯唑西林×√金黃色葡萄球菌和路鄧葡萄球菌30mg頭孢西丁√√除路鄧以外的凝固酶陰性葡萄球菌1mg苯唑西林×√30mg頭孢西丁√×17整理課件凝固酶陰性葡萄球菌中苯唑西林MIC結果的報告策略*苯唑西林MIC(μg/ml)進行mecA或PBP2a或頭孢西丁紙片擴散≤0.25≥4.00.5-2.0報告苯唑西林敏感報告苯唑西林耐藥陰性陽性報告苯唑西林敏感報告苯唑西林耐藥*檢測無菌部位感染的非表皮葡萄球菌菌株18整理課件克林霉素誘導耐藥葡萄球菌紅霉素*耐藥的金葡菌或凝固酶陰性葡萄球菌可對克林霉素結構性或誘導性耐藥或僅對紅霉素耐藥。

*或其他大環(huán)內酯類19整理課件機制耐藥基因紅霉素克林霉素核糖體修飾-藥物不能結合于靶位ermRS*RR結構性泵-藥物被泵出msrARSerm =erythromycinribosomemethylasemsrA =macrolidestreptograminresistance*需要誘導來顯示耐藥性

紅霉素/克林霉素耐藥葡萄球菌耐藥機制20整理課件誘導性克林霉素耐藥〔erm介導〕葡萄球菌-“D試驗〞患者不會對克林霉素有反響-報告克林霉素耐藥無克林霉素誘導〔msrA介導〕真的克林霉素敏感-報告克林霉素敏感“D〞陽性陰性15～26mm21整理課件葡萄球菌誘導性克林霉素耐藥的MIC檢測方法4.0 μg/ml紅霉素0.5 μg/ml克林霉素Nogrowth=無誘導性克林霉素耐藥生長=誘導性克林霉素耐藥22整理課件對于紅霉素耐藥，克林霉素敏感的葡萄球菌，需檢測誘導性克林霉素耐藥注意試驗適用于金葡菌和凝固酶陰性葡萄球菌(苯唑西林敏感和耐藥株)；對于CoNS，該試驗不必常規(guī)開展因為克林霉素很少用于治療凝固酶陰性葡萄球菌；大多數(shù)醫(yī)院相關MRSA是克林霉素耐藥的；大多數(shù)社區(qū)相關MRSA是克林霉素敏感的(msrA基因型)；克林霉素可以口服給藥。23整理課件萬古霉素中介耐藥的金黃色葡萄球菌〔VISA〕耐藥是由于：增厚的細胞壁檢測困難；表型不穩(wěn)定菌落形態(tài)不典型金葡菌萬古霉素敏感萬古霉素中介細胞壁24整理課件當有以下一個或多個情況時菌株可疑為VISA-內酰胺類藥物的MIC降低達托霉素MIC升高菌落形態(tài)不典型〔一些為微小菌落〕肉湯中生長緩慢〔如血培養(yǎng)〕凝固酶反響微弱/延遲經過幾次次代培養(yǎng)后：菌落回復為典型形態(tài)萬古霉素MIC降低并且菌株變?yōu)槿f古霉素敏感25整理課件萬古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌〔VRSA〕耐藥是由于從萬古霉素耐藥腸球菌（VRE）中獲得vanA基因美國報道例數(shù)9個患者檢測大多數(shù)標準方法均可檢測菌落形態(tài)典型金葡菌26整理課件紙片擴散法折點

葡萄球菌-萬古霉素CLSI文件Susceptible敏感Intermediate中介Resistant耐藥M100-S182008

15--New!新M100-S192009*---CLSIM100-S19.Table2C.對于金黃色葡萄球菌*假設抑菌圈≥7mm，用MIC法檢測萬古霉素〔假設有需要〕萬古霉素紙片擴散法僅在檢測攜帶van-A金葡菌〔VRSA〕時可信；需確證沒有抑菌圈(≤6mm)紙片擴散法不能鑒別VSSA和VISA紙片擴散法不能檢測凝固酶陰性葡萄球菌27整理課件腸球菌高水平氨基糖苷類耐藥篩查紙片擴散法120μg慶大霉素;300μg鏈霉素

10mm=無高水平氨基糖苷類耐藥MIC篩查慶大霉素:500μg/ml鏈霉素:1000μg/ml(肉湯) 2000μg/ml(瓊脂)28整理課件腸球菌氨基糖苷類修飾酶 鏈霉素慶大霉素妥布霉素阿米卡星/丁胺卡那6-AAD +-- -3’APH ---+2〞APH/6’AAC - + + +6’AAC* - - + +*在所有屎腸球菌中均發(fā)現(xiàn) +=酶可以修飾藥物；藥物無協(xié)同性-=酶不能修飾藥物；藥物有協(xié)同性29整理課件萬古霉素耐藥腸球菌〔VRE〕表型VRE－屎腸球菌中居多vanA

-高水平耐藥(MIC

256μg/ml)vanB

-中等水平耐藥(MIC16-

256μg/ml)低水平萬古霉素耐藥vanC-(MIC2-16μg/ml)vanC天然存在于鶉雞腸球菌和鉛黃腸球菌菌株不引起院內爆發(fā)，vanC基因不易于傳播紙片擴散法實驗可能檢測不出30整理課件快速MGP實驗，孵育3-5小時；甲基化-a-D-葡糖苷酸化＝黃色陽性陰性鉛黃腸球菌的黃色色素VRE31整理課件肺炎鏈球菌新的青霉素折點(μg/ml)敏感中介耐藥青霉素注射(非腦膜炎)≤24

8青霉素注射(腦膜炎)≤0.06-0.12青霉素(口服青霉素V)≤0.060.12-1

2CLSIM100-S19.Table2G.32整理課件紙片藥物含量抑菌圈(mm)MIC(μg/ml)等效的MICRISRS青霉素1μg苯唑西林--

20-≤0.06CLSIM100-S19.Table2G.肺炎鏈球菌

紙片擴散法-使用苯唑西林紙片作為青霉素敏感性的替代紙片33整理課件