ph和nacl濃度對(duì)絲膠蛋白聚集微觀結(jié)構(gòu)的影響

ph和nacl濃度對(duì)絲膠蛋白聚集微觀結(jié)構(gòu)的影響

絲膠蛋白功能生物材料的研究近年來，微膠囊、可口服復(fù)合物或片劑的多功能生物載體的應(yīng)用越來越受到重視。生產(chǎn)生物載體的原材料應(yīng)具有一些特殊性能,如在pH、離子強(qiáng)度、溫度和濃度等條件下具有合適的粒徑,形成合適的聚合形態(tài)以及特殊微觀結(jié)構(gòu)。目前這類材料多是化學(xué)合成,材料的安全性日益引起社會(huì)關(guān)注,天然無害的生物材料將成為健康安全食品醫(yī)藥的新趨勢(shì)。在過去的幾十年里,蛋白質(zhì)和多糖等生物大分子聚合物已經(jīng)引起科學(xué)家的注意。應(yīng)用這些材料制備生物載體,必須先了解材料的基本物理化學(xué)特性。pH和鹽對(duì)生物材料影響的相關(guān)理論、模型和試驗(yàn)數(shù)據(jù)已經(jīng)有大量的研究報(bào)道。絲膠是包覆在絲素蛋白外層的具有粘性的、水溶性的球狀蛋白。大量的研究證明,絲膠具有抗氧化、抗紫外輻射、抑菌、抑制酪氨酸酶和激酶活性等功能活性,且吸水性和持水性良好。因此絲膠具有作為多重功能活性生物材料的潛能。目前關(guān)于絲膠蛋白基本物理化學(xué)性質(zhì)的研究相當(dāng)有限,限制了絲膠蛋白作為生物材料的應(yīng)用。本文研究了pH和NaCl濃度對(duì)絲膠蛋白粒徑分布以及微觀結(jié)構(gòu)等物理化學(xué)特性的影響。采用Zeta電勢(shì)法測(cè)定了絲膠蛋白的等電點(diǎn),探討了絲膠蛋白表面電荷隨環(huán)境pH和離子強(qiáng)度變化的影響。應(yīng)用動(dòng)態(tài)光散射法(dynamiclightscattering,DLS)探測(cè)了絲膠蛋白顆粒的粒徑分布和變化,結(jié)合透射電鏡(transmissionelectronmicroscopy,TEM)和近紅外光譜(infraredspectroscopy,IR)分析了絲膠蛋白聚集的微觀結(jié)構(gòu)和構(gòu)形變化,為絲膠蛋白生物材料的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。1材料和方法1.1除雜質(zhì),潤(rùn)洗潤(rùn)洗桑蠶(Bombyxmori.L)蠶繭剪成約1cm2大小,用自來水仔細(xì)淘洗去除雜質(zhì),用蒸餾水潤(rùn)洗。洗凈的蠶繭以25∶1(w/v)的比例加蒸餾水于沸水下煮2h,收集絲膠溶液、濃縮、凍干備用。1.2na4r65FTIR光譜分析采用NicoletMagna4R560,分辨率為4cm-1。干燥的絲膠蛋白粉末與FTIR級(jí)KBr混合均勻,壓成薄片,即刻進(jìn)行FTIR掃描。1.3zeta電勢(shì)的測(cè)定采用ZetasizerZS-90電勢(shì)粒徑儀(MalvernInstrumentsLtd.,Malvern,UK)測(cè)定絲膠蛋白溶液的zeta電勢(shì)。絲膠蛋白濃度為0.2mg·mL-1,用HCl和NaOH調(diào)整pH后立即測(cè)量。1.4關(guān)于系統(tǒng)固有定理的測(cè)量,有相關(guān)說明的說明,有以下幾個(gè)采用基于電荷斥力和范德華吸引力平衡的DLVO理論模型來建立絲膠蛋白顆粒聚集模型。膠體系統(tǒng)的相對(duì)穩(wěn)定或者聚沉取決于斥力能和吸力能共同作用結(jié)果的推斥能VR的大小,推斥能VR隨粒子間距離x的變化而變化該模型在相關(guān)文獻(xiàn)中有詳細(xì)論述。VR=Aψ2exp(?κx)(1)VR=Aψ2exp(-κx)(1)其中A為系統(tǒng)固有常數(shù),ψ為zeta電勢(shì),κ-1為粒子雙電子層的Debye-Huckel長(zhǎng)度或厚度κ=B?I√(2)κ=B?Ι(2)其中B是電解質(zhì)溶液的固有常數(shù),I是離子強(qiáng)度,離子強(qiáng)度可以用電導(dǎo)儀測(cè)定。由方程(1)和方程(2)推導(dǎo)出方程(3)x=ln(Aψ2VR)/BI√(3)x=ln(Aψ2VR)/BΙ(3)當(dāng)VR=1kT時(shí),方程(3)可以簡(jiǎn)化得到方程(4)x∝ln(|ψ|)I√(4)x∝ln(|ψ|)Ι(4)方程(4)中,粒子間的距離與zeta電勢(shì)的對(duì)數(shù)ln(|ψ|)成正比,與離子強(qiáng)度I1/2成反比。1.5mw瞳余光粉的表征絲膠粒徑采用NICOMP380ZLS-Zeta電勢(shì)/粒徑儀測(cè)定,工作條件為5mW氦氖光源,波長(zhǎng)632.8nm,散射角度90°,溫度25℃。絲膠濃度為0.2mg·mL-1,經(jīng)0.45μm過濾器過濾,樣品用HCl或NaOH溶液調(diào)整pH。計(jì)算機(jī)自動(dòng)對(duì)光密度進(jìn)行收集,采用累積分析法得到絲膠蛋白粒徑及其分布。1.6掃描電鏡sem采用JEOLJEM-1230透射電鏡對(duì)顆粒的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行了掃描,電鏡工作電壓為80kV。取一滴0.2mg·mL-1的絲膠蛋白溶液置于銅網(wǎng)格上,多余的溶液用無塵濾紙移除,空氣中風(fēng)干約10min,將銅網(wǎng)置于在透射電鏡下掃描。2結(jié)果與討論2.1蛋白結(jié)構(gòu)的測(cè)定圖1為絲膠蛋白凍干粉末的IR光譜,圖譜中只有酰氨Ⅰ帶1700～1600cm-1附近有較強(qiáng)吸收峰,主要是蛋白質(zhì)中CO伸縮振動(dòng)引起,一般認(rèn)為,β-折疊和無規(guī)則卷曲分別在1630和1650cm-1附近有較強(qiáng)吸收,因此可以確定絲膠蛋白主要含有β-折疊和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu),這與大多數(shù)文獻(xiàn)的結(jié)論一致。也有學(xué)者認(rèn)為絲膠蛋白中含有大約不到11%的α-螺旋。2.2zeta含量測(cè)定絲膠蛋白表面電勢(shì)試驗(yàn)測(cè)定了0,0.06和0.9mol·L-1NaCl溶液中的絲膠蛋白在不同pH下的zeta電勢(shì)(圖2)。由圖可知,0mol·L-1NaCl,低pH值時(shí),絲膠蛋白的表面電勢(shì)為正值,當(dāng)pH值低于3.0時(shí),電勢(shì)達(dá)到穩(wěn)定,約35mV;高pH值時(shí),電勢(shì)為負(fù)值,當(dāng)pH值高于5.0時(shí),電勢(shì)達(dá)到穩(wěn)定,約-45mV。0,0.06mol·L-1NaCl溶液中絲膠蛋白的等電點(diǎn)pI為3.7,這結(jié)論與Kodama用沉淀法測(cè)得的3.9非常相近。0.06mol·L-1NaCl絲膠溶液在pH值為2～3時(shí),zeta電勢(shì)值降至20mV。在0.9mol·L-1NaCl溶液中,由于絲膠蛋白的表面電荷被相反電荷的離子屏蔽,無法測(cè)定。2.3動(dòng)態(tài)光散射法檢測(cè)絲膠蛋白的微觀結(jié)構(gòu),主要考當(dāng)一對(duì)粒子帶有相同電荷,靜電排斥力會(huì)阻止凝聚的發(fā)生;如果顆粒帶電為中性,范德華力和氫鍵有利于形成凝聚,從而增大顆粒粒徑。在方程(4)中,根據(jù)粒子間距離的變化,確定粒子凝聚的可能性。當(dāng)離子強(qiáng)度不變時(shí),可以得到方程(5)來表達(dá)粒子間距離xx∝=ln(|ψ|)(5)x∝=ln(|ψ|)(5)ln(|ψ|)越大,意味著粒子間距離越遠(yuǎn),也就是說粒子越難聚集;相反,ln(|ψ|)越小,說明粒子越容易聚集。圖3(a)中可以看到,隨著pH值遠(yuǎn)離pI而增大,在pI附近時(shí)最小,這一模型跟光散射測(cè)定的結(jié)果一致。圖4為絲膠蛋白在pH4,8和3時(shí)的TEM照片。在pH4[圖4(a)]時(shí),可以觀察到絲膠蛋白聚集且微觀結(jié)構(gòu)非常緊密,由許多球狀單體堆疊在一起,球狀單體的粒徑約為(60±6)nm(隨機(jī)選取照片中10個(gè)單體計(jì)算所得)。相反,在pH8[圖4(b)]時(shí)形成相對(duì)疏松的松枝狀結(jié)構(gòu)。在pH3[圖4(c)]時(shí)形成類似pH8時(shí)的松針結(jié)構(gòu),但相對(duì)緊密。但在pH3和8時(shí),延伸的分枝體代替了pH4時(shí)的緊密單體小球。這種現(xiàn)象可能歸結(jié)于靜電排斥力引起的無規(guī)則聚合鏈的排斥體積增加。聚合物鏈單體被排斥的部分都會(huì)被其他單體占據(jù)重疊,從而促成聚合物鏈的延長(zhǎng)。pH=pI時(shí),聚合物容易聚集在一起,而在pH遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)蛋白顆粒膨脹延伸。此外,IR光譜的未隨著pH的變化而變化(數(shù)據(jù)未列出),也就是說絲膠蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)未受到pH的影響。基于以上動(dòng)態(tài)光散射的測(cè)量、聚集模型的建立以及透射電鏡掃描的結(jié)果,可以認(rèn)為絲膠蛋白聚集的構(gòu)形和微觀結(jié)構(gòu)都是靜電排斥力和吸引的范德華引力和氫鍵共同作用的結(jié)果。相關(guān)文獻(xiàn)中pH對(duì)β-乳球蛋白,大豆蛋白等產(chǎn)生了類似的影響,如β-乳球蛋白在等電點(diǎn)5.1時(shí)會(huì)形成八聚體,在酸性或者堿性條件下又會(huì)解聚。2.4蛋白單體的結(jié)構(gòu)表征圖3(b)為光散射法測(cè)定絲膠蛋白顆粒粒徑隨鹽濃度變化的結(jié)果,其中pH恒定為8。當(dāng)NaCl濃度從0mol·L-1升高到0.1mol·L-1時(shí),絲膠蛋白的粒徑從350nm迅速上升到900nm,同時(shí)多分散系數(shù)也從0.6提高到1.8。當(dāng)NaCl濃度升高到0.9mol·L-1時(shí),粒徑穩(wěn)定在約860nm大小,多分散系數(shù)也從1.4變化到2.4。這些都表明,溶液中的NaCl使絲膠蛋白顆粒的聚集,而且NaCl為0.1mol·L-1時(shí)會(huì)開始形成最大的聚集。粒子間距離x可以從方程(4)推導(dǎo)得到方程(6)x∝=ln(|ψ|)/I√(6)x∝=ln(|ψ|)/Ι(6)電勢(shì)值可從圖2中獲得,如0mol·L-1NaCl濃度時(shí),zeta電勢(shì)為-50mV,如0.06mol·L-1NaCl濃度時(shí),zeta電勢(shì)為-23mV。由于蛋白質(zhì)本身是一種電解質(zhì),即使在沒有添加NaCl時(shí),其離子強(qiáng)度為3×10-5mol·L-1。從圖中可以看到溶液NaCl濃度為0.06mol·L-1時(shí),迅速下降,說明0.06mol·L-1的NaCl會(huì)促進(jìn)絲膠蛋白的聚集。圖5是在0.06和0.09mol·L-1NaCl下絲膠蛋白微觀結(jié)構(gòu)的TEM照片。如前所述,pH8時(shí),絲膠蛋白表面的靜電斥力阻止了蛋白的聚集。而加入NaCl后,蛋白表面電荷被相反離子(如Na+)屏蔽了,從而導(dǎo)致了蛋白的聚集。在TEM照片中,可以觀察到絲膠蛋白聚集成微晶,這些微晶主要由β-折疊結(jié)構(gòu)組成。通過吸收水分絲膠蛋白的無規(guī)則卷曲可以通過拉鏈?zhǔn)綒滏I鏈的形成轉(zhuǎn)化成β-折疊,甚至在干燥的條件下也可以保持結(jié)晶態(tài)。低嚴(yán)濃度下[0.06mol·L-1NaCl,圖5(a)]絲膠蛋白的微觀結(jié)構(gòu)比無NaCl時(shí)[圖4(b)]更緊密。相比在低鹽濃度下,高鹽濃度下[0.9mol·L-1NaCl,圖5(b)]絲膠蛋白表面電荷被徹底屏蔽,凝聚相對(duì)更緊密和集中。類似的鹽促成蛋白質(zhì)沉淀在乳清蛋白和大豆蛋白的研究也有報(bào)道?；谝陨戏治?絲膠蛋白單體在等電點(diǎn)時(shí)為緊密的球形,易形成緊密的凝聚體且聚集是無規(guī)則的。當(dāng)pH遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí),絲膠蛋白單體膨脹,由于絲膠蛋白單體表面電荷分布不均勻,單體間的聚集具有選擇性。沒有鹽的條件下,絲膠蛋白形成松枝狀聚合物;添加NaCl后,絲膠蛋白會(huì)大量聚集成微晶狀。3p