體內(nèi)藥物分析

體內(nèi)藥物分析Biopharmaceuticalanalysis中山大學(xué)藥學(xué)院徐月紅第一節(jié)體內(nèi)藥物分析概述一、體內(nèi)藥物分析的定義研究生物機(jī)體中藥物及其代謝物和內(nèi)源性性物質(zhì)的質(zhì)和量變化規(guī)律的分析方法學(xué)。二、體內(nèi)藥物分析的意義（一）在新藥評(píng)價(jià)和開(kāi)發(fā)中的意義

1．全面質(zhì)量控制

2．新藥報(bào)批

3．為設(shè)計(jì)新藥提供信息

①?gòu)拇x產(chǎn)物中開(kāi)發(fā)新藥保泰松→羥基保泰松（作用強(qiáng)、副作用小）非那西丁→撲熱息痛

②前藥設(shè)計(jì)

③新劑型的研究，緩控釋、經(jīng)皮制劑等以上內(nèi)容必須通過(guò)測(cè)定體內(nèi)藥物濃度得以解決（二）臨床合理用藥中的意義

1．血藥濃度與藥理作用2.影響血藥濃度的因素（1）機(jī)體因素

a．生理因素年齡、性別、生理狀況

b．病理因素

c．遺傳因素（2）藥物因素

a．劑型因素（生物利用度問(wèn)題）

b．藥物合并使用（酶抑、酶促）

c．時(shí)間因素（三）藥物中毒解救的意義（四）興奮劑檢測(cè)的意義三、體內(nèi)藥物分析的對(duì)象3．從樣品的來(lái)源分1．從分析物分母體藥物代謝物內(nèi)源性物質(zhì)2．從生物樣品種類分均勻樣品非均勻樣品人體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物四、體內(nèi)藥物分析的任務(wù)（一）方法學(xué)的研究（二）治療藥物監(jiān)測(cè)

TDM，therapeuticalDrugMonitoring1．定義2．哪些藥物需進(jìn)行體內(nèi)血藥濃度監(jiān)測(cè)①有效血藥濃度范圍窄，稍高毒性大，稍低無(wú)療效②劑量小，毒性大的藥物③個(gè)體差異大，劑量難以控制④藥物毒性反應(yīng)與疾病癥狀相似⑤多種藥物合并應(yīng)用，有中毒危險(xiǎn)⑥胃腸道、肝臟、腎臟疾?、叱史蔷€性動(dòng)力學(xué)的藥物⑧判斷患者用藥的依從性（三）藥代動(dòng)力學(xué)的研究（四）代謝分型的應(yīng)用（五）內(nèi)源性物質(zhì)測(cè)定

五、體內(nèi)藥物分析的特點(diǎn)1．干擾雜質(zhì)多2．樣品濃度低3．取樣量少4．工作量大5．時(shí)間短6．有一定設(shè)備六、體內(nèi)藥物分析方法1.光譜分析法：比色法、紫外法、熒光和原子吸收分光光度法2.色譜分析法：TLC、TLCS、GC、HPLC、HPCE3.免疫分析法：IA4.電化學(xué)分析法靈敏度專屬性光譜法++剛開(kāi)始應(yīng)用較多，雙波長(zhǎng)，導(dǎo)數(shù)色譜法++++++HPLCGC免疫法++++++免疫交叉反應(yīng)，重現(xiàn)性七、體內(nèi)藥物分析的發(fā)展1．國(guó)外發(fā)展概況60年代初 發(fā)現(xiàn)藥效與血藥濃度關(guān)系70年代 體內(nèi)藥物分析方法建立80年代~至今 發(fā)展迅猛，新儀器不斷涌現(xiàn)書籍出版《DrugLevelMonitoring》 1980《TherapeuticalDrugMonitoring》 1981《TextbookofBiopharmaceuticAnalysis》 19812．國(guó)內(nèi)情況

80年代初，藥物分析工作者倡導(dǎo)，1980年版《藥物分析》教材中納入部分內(nèi)容，第二、三版增加體內(nèi)藥物分析一章。第四版、第五版取消，各學(xué)校開(kāi)設(shè)體內(nèi)藥物分析課程。

80年代開(kāi)始在醫(yī)院進(jìn)行臨床藥學(xué)工作，主要測(cè)定藥物濃度。有關(guān)書籍吳如金《體內(nèi)藥物分析》 人衛(wèi)版 1984陸明廉《血藥濃度測(cè)定與臨床應(yīng)用》上?？萍?1986陳剛《治療藥物監(jiān)測(cè)理論與實(shí)踐》人民軍醫(yī) 1988吳萊文《治療藥物監(jiān)測(cè)》 人衛(wèi)版 1989曾經(jīng)澤《生物藥物分析》 北京大學(xué)出版社1998姚彤煒《體內(nèi)藥物分析》 浙大 2001張君仁《體內(nèi)藥物分析》 化學(xué)工業(yè)出版社 20023．學(xué)科前沿游離藥物濃度測(cè)定直接進(jìn)樣方法研究代謝物測(cè)定對(duì)映體分析第二節(jié)體內(nèi)藥物分析的研究現(xiàn)狀一、臨床藥理學(xué)（ClinicalPharmacology)

體液中藥物濃度的測(cè)定二、臨床藥學(xué)藥物代謝動(dòng)力學(xué)

TDM三、新藥體內(nèi)研究《藥品注冊(cè)管理辦法》化學(xué)藥品：22、復(fù)方制劑中多種成份藥效、毒性、藥代動(dòng)力學(xué)相互影響的試驗(yàn)資料及文獻(xiàn)資料。27、非臨床藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)資料及文獻(xiàn)資料。中藥：28、動(dòng)物藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)資料及文獻(xiàn)資料。四、治療藥物檢測(cè)利用現(xiàn)代的分析測(cè)試技術(shù)來(lái)測(cè)定血液或其他體液中的藥物及其代謝物的濃度，并運(yùn)用藥代動(dòng)力學(xué)原理，實(shí)施給藥方案?jìng)€(gè)體化以提高藥物療效，避免或降低藥物的毒副作用，從而實(shí)現(xiàn)真正意義上的合理用藥。對(duì)象：血清、血漿、全血五、藥物代謝產(chǎn)物的研究目的：了解藥物在體內(nèi)的命運(yùn)及相互作用，保證臨床用藥安全有效研究藥物代謝途徑、藥物結(jié)構(gòu)與藥理作用關(guān)系，尋找新藥研究藥物相互作用機(jī)制有利于建立體內(nèi)藥物分析新方法，避免代謝物干擾途徑：第一相反應(yīng)：在酶作用下發(fā)生的氧化、還原、水解，使極性增加，水溶性增強(qiáng)第二相反應(yīng)：藥物或經(jīng)一相反應(yīng)后的代謝物與葡萄糖醛酸、硫酸鹽結(jié)合等，使分子極性進(jìn)一步加大，有利于從尿中排出，結(jié)合過(guò)程通常使藥物滅活。藥物代謝的研究事項(xiàng)：1．樣品的保存樣品可能會(huì)分解，如血漿酯酶可使酯類藥物水解，酶類可使藥物繼續(xù)代謝，加入酶抑制劑和冷藏保存。2．分析方法選擇光譜法色譜法免疫法3．樣品的提取、分離法代謝物極性大、水溶性強(qiáng)，pH緩沖系統(tǒng)分開(kāi)尿液中藥物多以結(jié)合型存在，要進(jìn)行水解（酸水解、酶水解，溶劑解）六、內(nèi)源性活性化合物的測(cè)定

P417表19－1體內(nèi)內(nèi)源性化合物與疾病的關(guān)系第三節(jié)體內(nèi)藥物分析的研究熱點(diǎn)一、游離型血藥濃度測(cè)定方法學(xué)研究二、體內(nèi)微量元素的測(cè)定研究三、體內(nèi)對(duì)映體藥物的研究四、中藥成分代謝分析五、不經(jīng)預(yù)處理的直接進(jìn)樣測(cè)定技術(shù)研究六、微透析技術(shù)的研究七、在體藥物檢測(cè)技術(shù)的研究第四節(jié)體內(nèi)藥物存在的狀態(tài)與

體內(nèi)藥物分析的關(guān)系一、藥物的體內(nèi)變化吸收→分布→代謝→排泄ADME過(guò)程發(fā)生兩種變化物理變化可逆變化化學(xué)變化結(jié)構(gòu)和數(shù)量發(fā)生變化二、藥物與血漿蛋白的結(jié)合1．游離型藥物與結(jié)合型藥物（非特異性的結(jié)合）①在血漿、組織中均存在游離型和結(jié)合型的藥物②尿液中含微量P，血漿中含大量P，唾液中P為血漿1/10③與藥物結(jié)合的蛋白主要有白蛋白，a1-酸性糖蛋白、脂蛋白弱酸性藥物主要與白蛋白結(jié)合弱堿性藥物與白蛋白、a1-酸性糖蛋白結(jié)合④藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合通過(guò)共價(jià)鍵（氫鍵，離子間靜電力等）2．血漿蛋白結(jié)合率Df+PDbK=解離常數(shù)血漿蛋白結(jié)合率：Β==[P]·[Df]DbDbDb+Df11+K/np+Df/np結(jié)合力強(qiáng)的藥物可以置換結(jié)合力弱的藥物，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)蛋白是藥物相互作用類型之一。由此可見(jiàn)，K、np是影響β的重要因素

np↓β↓K↓β↑

藥物在足夠高濃度時(shí)使結(jié)合部位飽和，濃度再增高，多余的藥物均呈游離狀態(tài)，結(jié)合部分比率降低，藥物血漿蛋白結(jié)合率是藥代動(dòng)力學(xué)的重要參數(shù)之一。3．血漿蛋白結(jié)合的測(cè)定平衡透析法、超濾法、凝膠過(guò)濾法、光譜法等。（1）平衡透析法

①原理

②計(jì)算β=×100%=Ct-Cf/Ct×100%袋內(nèi)-袋外袋內(nèi)藥物③注意事項(xiàng)a.蛋白質(zhì)溶液新鮮血漿pH7.4，至少三個(gè)濃度測(cè)定b.緩沖液0.13mol/L磷酸鹽緩沖液，因?yàn)镹a3PO4抑制酸性藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合c.溫度與平衡時(shí)間37℃16~48h注意防腐劑加入，藥物的分解d.透析袋滲漏檢測(cè)3%三氯醋酸e.攪拌保持動(dòng)態(tài)平衡④影響因素a.藥物膜上吸附b.Donnan效應(yīng)由于電荷的影響，可造成平衡時(shí)半透膜兩側(cè)游離藥濃不同，donnan效應(yīng)，加入中性鹽可消除。c.空白值增加d.緩沖液體積變化，水分進(jìn)入血漿游離藥濃↑此法用于測(cè)定藥物時(shí)，耗費(fèi)時(shí)間太長(zhǎng)，一般少采用（2）超濾法原理計(jì)算注意事項(xiàng)

a．裝置50μl→5ml，選擇不同型號(hào)超濾膜，保濕。

b．速度與時(shí)間3000~10000r/min5~15minc．溫度37℃，25℃，4℃影響因素

a．膜吸附

b．超濾液的體積超濾液/總體積≈0.3~0.6

c．超濾膜溫度三、藥物與血漿蛋白結(jié)合對(duì)體內(nèi)藥物分析的影響1．血漿不同對(duì)體內(nèi)藥物分析的影響2．平衡狀態(tài)不同對(duì)體內(nèi)藥物分析的影響3．平衡狀態(tài)受破壞對(duì)體內(nèi)藥物分析的影響4．游離與結(jié)合同時(shí)出現(xiàn)時(shí)對(duì)體內(nèi)藥物分析的影響四、藥物代謝1．研究藥物代謝的意義了解藥物在體內(nèi)的命運(yùn)及相互作用，保證臨床用藥安全有效研究藥物代謝途徑、藥物結(jié)構(gòu)與藥理作用關(guān)系，尋找新藥研究藥物相互作用機(jī)制有利于建立體內(nèi)藥物分析新方法，避免代謝物干擾2．藥物代謝的途徑第一相反應(yīng)：在酶作用下發(fā)生的氧化、還原、水解，使極性增加，水溶性增強(qiáng)第二相反應(yīng)：藥物或經(jīng)一相反應(yīng)后的代謝物與葡萄糖醛酸、硫酸鹽結(jié)合等，使分子極性進(jìn)一步加大，有利于從尿中排出，結(jié)合過(guò)程通常使藥物滅活。氧化反應(yīng)還原反應(yīng)水解反應(yīng)結(jié)合反應(yīng)

a．葡萄糖醛酸結(jié)合

b．硫酸酯化

c．谷胱甘肽綴合

d．乙?；Y(jié)合

e．氨基酸結(jié)合五、藥物代謝與體內(nèi)藥物分析的關(guān)系1．樣品的保存樣品可能會(huì)分解，如血漿酯酶可使酯類藥物水解，酶類可使藥物繼續(xù)代謝，加入酶抑制劑和冷藏保存。2．分析方法選擇光譜法色譜法免疫法3．樣品的提取、分離法代謝物極性大、水溶性強(qiáng)，pH緩沖系統(tǒng)分開(kāi)尿液中藥物多以結(jié)合型存在，要進(jìn)行水解（酸水解、酶水解，溶劑解）第五節(jié)生物樣品的預(yù)處理一、生物樣品的采集與貯藏體內(nèi)藥物分析常用的分析品種有血液、尿液、唾液，也可用乳汁、淚液、腦脊液、膽汁等。（一）樣品的采集1．血樣血樣濃度與作用點(diǎn)的濃度密切相關(guān)，可以反映靶器官的濃度。血細(xì)胞血漿（plasma）血小板血清（serum）血細(xì)胞測(cè)定血樣中平均分布于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的藥濃抗凝自然全血血液2．尿樣目的：藥物劑量回收，藥物清除，藥物代謝和生物利用度特點(diǎn)：濃度高，易于收集，體內(nèi)代謝研究，應(yīng)水解分離3．唾液唾液中藥濃與血濃相關(guān)性收集方法離心收集（二）樣品的貯藏1．血樣（血漿、血清）及時(shí)分離→冷藏，-70℃加入穩(wěn)定劑NaF2．尿樣

①尿中水、無(wú)機(jī)鹽、尿素等細(xì)菌的生長(zhǎng)，4℃保存

②加入防腐劑a．1%甲苯b．飽和氯仿c．pH改變3．唾液：同血樣二、生物樣品的預(yù)處理（一）預(yù)處理的目的

①存在形式的多樣性游離結(jié)合代謝物

②濃度低，雜質(zhì)多（分離濃縮）

③出現(xiàn)渾濁和沉淀

④與試劑起反應(yīng)

⑤影響色譜柱壽命（二）處理方法選擇的一般原則1．藥物理化性質(zhì)

pKa親脂性揮發(fā)性溶解度光譜特征穩(wěn)定性2．濃度范圍靈敏的方法3．測(cè)定的目的定性定量母體代謝4．生物樣品的種類5．樣品處理與分析方法的選擇

①專一性②靈敏性（三）生物樣品去蛋白處理1．加入與水能混溶的有機(jī)溶劑及中性鹽甲醇乙腈甲醇1:2乙腈1:1.5（NH4）2SO4NaCl2．加入酸性沉淀劑三氯醋酸高氯酸苦味酸等使蛋白質(zhì)分子的陽(yáng)離子形成不溶性鹽而↓，pH低于等電點(diǎn)3．組織酶消化法加入酶使蛋白質(zhì)水解優(yōu)點(diǎn)：①平衡條件下進(jìn)行，可避免反應(yīng)和降解

②可改善對(duì)蛋白結(jié)合率強(qiáng)的藥物的回收率

③不產(chǎn)生乳化4．其他加熱超濾（四）生物樣品綴合物水解1．酸水解2．酶水解

β-葡萄糖醛酸苷酶芳基硫酸酯酶混合酶

pH4.5-7.037℃3．溶劑解某些藥物的硫酸酯，往往加入率取溶劑時(shí)發(fā)生分解，同時(shí)提取有機(jī)溶劑中（五）生物樣品的萃取1．液-液萃?。?）優(yōu)點(diǎn)：①與雜質(zhì)分離②簡(jiǎn)便

③濃集④提取率高（2）提取率：在有機(jī)相與水相中的溶解度的比值分配系數(shù)，一般少量多次，對(duì)生物樣品一般一次萃取，>70%重現(xiàn)性（3）影響提取率的因素

①pH堿性藥物在堿性pH酸性酸性pH②提取溶劑相似相溶原理沸點(diǎn)低，不影響檢測(cè),性質(zhì)穩(wěn)定，不起化學(xué)反應(yīng)

③離子強(qiáng)度加入中性鹽增加離子強(qiáng)度，與水結(jié)合強(qiáng)，便于有機(jī)溶劑提?。?）離子對(duì)提取對(duì)于離子性特強(qiáng)，水溶性極大的藥物，可采用離子對(duì)提?、僭恝趹?yīng)用陰離子：COOH+SO3H-

反離子四丁基銨陽(yáng)離子：NH2+

反離子烷基或芳基磺酸鹽（5）提取技術(shù)一般在試管中進(jìn)行有機(jī)相與水相比1:1或2:1（6）乳化問(wèn)題措施

①輕緩振搖

②含有分散度大或不溶物應(yīng)過(guò)濾掉

③避免在高pH條件下，從水中提取藥物

④避免使用易發(fā)生乳化的溶劑

⑤萃取劑水中加入少量NaCl破孔方法

①機(jī)械法

②加入少量高級(jí)脂肪醇改變表面張力

③改善混合溶劑比例，增加分散相分?jǐn)?shù)（7）藥物的吸附①玻璃容器吸附1%三甲一氯硅烷10%二甲二氯硅烷②血漿2．液固萃取固相萃取[solidphaseextractionSPE]針管式抽空減壓加壓過(guò)濾（1）固相萃取步驟①固相選擇樣品1ml1ml規(guī)格固相1~25ml3ml規(guī)格固相②固相處理反相C18

固定相的6~10倍體積甲醇洗柱，使溶劑化

6~10倍水緩沖服液沖洗達(dá)分離狀態(tài)③上樣④分離用適當(dāng)?shù)娜跞軇┫礈煜慈ルs質(zhì)，通N2干燥固相⑤洗脫待測(cè)物改變pH或極性（2）影響固相萃取的因素（1）流速流速快，按觸不充分，樣品流失回收率低柱處理5~10ml·min-1

洗脫0.2~1ml·min-1（〈300mg〉2~5ml·min-1（>300mg）（2）裝樣過(guò)載突破性試驗(yàn)已知濃度樣品液

①小體積上柱→洗脫回收百分率

②加大體積→洗脫回收百分率

③繪圖當(dāng)回收率下降時(shí)為過(guò)載（六）生物樣品的組分濃集（七）衍生化處理

GC衍生化

HPLC衍生化第六節(jié)體內(nèi)藥物分析方法的建立與評(píng)價(jià)一、分析方法靈敏度專屬性光譜法++剛開(kāi)始應(yīng)用較多雙波長(zhǎng)，導(dǎo)數(shù)色譜法++++++HPLCGC免疫法++++++疫交叉反應(yīng)，重現(xiàn)性根據(jù)藥物理化性質(zhì)，結(jié)構(gòu)特征，藥物濃度，干擾成分大小，實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù)方法的建立原始方法改進(jìn)→創(chuàng)新創(chuàng)立方法1．做好文獻(xiàn)總結(jié)2．充分了解藥物特征及體內(nèi)狀況

pH、親脂性、溶解度、極性、光譜特征、藥動(dòng)學(xué)參數(shù)、體內(nèi)代謝情況3．明確測(cè)定目的、要求目的4．結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件

設(shè)備條件

預(yù)處理方法藥濃監(jiān)測(cè)藥代動(dòng)力學(xué)研究母體藥物和代謝物三、分析方法的建立1．純品進(jìn)行測(cè)定確定線性范圍、靈敏度、反應(yīng)條件（pH、t、T）2．空白樣品測(cè)定確定空白樣品是否有干擾3．以水代替空白樣品，加標(biāo)準(zhǔn)液后測(cè)定了解提取率、檢測(cè)濃度確定萃取條件、pH、揮發(fā)濃縮等4．空白樣品加入標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

回歸方程

回收率5．實(shí)驗(yàn)樣品測(cè)定

四、分析方法的評(píng)價(jià)可行性和可靠性

1．準(zhǔn)確度

accuracy

測(cè)定結(jié)果與真實(shí)性的差異用回收率表示

①接近100%②相對(duì)恒定①絕對(duì)回收率也稱萃取回收率、提取回收率測(cè)定血漿樣品中藥物濃度/相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液=絕對(duì)回收率考慮3個(gè)濃度（高、中、低）

分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線成上、中、下一般要求絕對(duì)回收率在≥70%一般方法 HPLC內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)法時(shí)注意：藥物與內(nèi)標(biāo)用各自外標(biāo)法測(cè)定回收率應(yīng)相近，差值<10%②相對(duì)回收率方法回收率藥物系列濃度+血樣→標(biāo)準(zhǔn)曲線取高、中、低三濃度加入到空白血漿中，處理后測(cè)定，與加入標(biāo)準(zhǔn)量相比，得方法回收率，測(cè)定值<15%，定量限<20%注意問(wèn)題：

a．加入藥量與實(shí)際測(cè)定值相近

b．加入物與實(shí)際存在狀