揮發(fā)性脂肪酸和乳酸的測定

揮發(fā)性脂肪酸和乳酸的測定

發(fā)酸脂肪酸（vf）和硫酸是飼料沉淀過程中的主要產(chǎn)物。其中，醋酸和醋酸可以有效降低環(huán)境的ph值，抑制不耐酸分解的腐敗菌的生長，丙酸鈉可以抑制細(xì)菌的繁殖，丁酸鈉與青駐扎飼料的腐敗有關(guān)。因此，其含量和組成比例可反映出青駐扎飼料的質(zhì)量和質(zhì)量優(yōu)良。這是評估青儲(chǔ)備質(zhì)量的重要指標(biāo)。有機(jī)酸的分析方法有比色法、滴定法、色譜法等。相比之下，氣相色譜法以快速、準(zhǔn)確、簡便，能同時(shí)測定多個(gè)組分而被廣泛應(yīng)用，但氣相色譜法也受多種條件的影響，如色譜條件、樣品的處理方法等。目前報(bào)道的同時(shí)測定VFAs和乳酸的氣相色譜法中，除色譜條件差別很大外，主要以外標(biāo)法為主，且乳酸需要進(jìn)行復(fù)雜費(fèi)時(shí)的前處理。外標(biāo)法雖然簡單、方便，但受進(jìn)樣量和載氣量的影響較大，精密度也不高，在氣相色譜定量分析中還是以內(nèi)標(biāo)法更理想。為此，本試驗(yàn)選用巴豆酸為內(nèi)標(biāo)物，探討無需任何前處理便能同時(shí)測定VFAs和乳酸含量的最佳色譜條件。1材料和方法1.1色譜標(biāo)準(zhǔn)島津2010型氣相色譜儀、氫火焰離子化檢測器（FID）、HP-INNOWAX(19091N-133）毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm）、微量注射器（10μL）、高純氫氣（99.99%）、高純氮?dú)猓?9.99%）、鋼瓶空氣、乙酸、丙酸和丁酸的色譜純標(biāo)準(zhǔn)溶液（國藥）、DL-乳酸（生工）、巴豆酸（國藥）。1.2檢測室溫度柱溫采用程序升溫方法，初始溫度120℃，采用10℃/min的速率升溫至220℃，保持2min。氣化室溫度250℃，檢測室溫度270℃。載氣使用高純氮?dú)?，總壓力?60kPa，總流量為80.7mL/min，柱流量1.89mL/min，線速度44.7cm/s，分流比40∶1，吹掃流量3.0mL/min，循環(huán)流量30.0mL/min,H2流量40mL/min，空氣流量400mL/min。1.3溶液制備1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液1.3.2標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的制備量取乙、丙、丁酸的色譜純標(biāo)準(zhǔn)品和乳酸的分析純適量，分別加入6μL1mol/L的內(nèi)標(biāo)溶液，以超純水稀釋至1mL，制成乙、丙、丁酸濃度分別為2、4、6、8、10mmol/L，乳酸濃度均為12、24、36、48、60mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。1.3.3對照品溶液的配制分別取乙、丙、丁酸的色譜純標(biāo)準(zhǔn)品和乳酸分析純各適量，加入定量的內(nèi)標(biāo)溶液，用高純水稀釋至1mL后，搖勻，配成3種不同濃度的對照品溶液，見表1。1.3.4待測溶液配制分別取乙、丙、丁酸的色譜純標(biāo)準(zhǔn)品和乳酸分析純各適量，加入定量的內(nèi)標(biāo)溶液，用高純水稀釋至1mL后，搖勻，配出表2中不同濃度組分的待測溶液。1.4偏磷酸+巴豆酸溶液的制備取剪碎的青貯玉米70g(W）于具塞三角瓶中，加入150mL的蒸餾水后，放入4℃冰箱內(nèi)浸取24h，期間每隔6h均勻搖晃三角瓶5min，以保證浸取完全。浸取完畢后進(jìn)行過濾，將提取物用80目滌綸篩網(wǎng)過濾液擠盡，通過定量濾紙過濾于500mL(V）的容量瓶中定容、搖勻。取提取液5mL(V1）于10mL離心管中并分別加入1mL25%的偏磷酸和1mL42mmol/L的巴豆酸（保證內(nèi)標(biāo)物濃度一致），振蕩、靜置30min后離心10min，取上清液用于上機(jī)分析。青貯飼料鮮樣中各種有機(jī)酸的總量可按下式計(jì)算：其中，P%為內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線上各組分的含量。2結(jié)果與分析2.1色度分析的條件選擇2.1.1毛細(xì)管柱的選擇乙、丙、丁和乳酸均為強(qiáng)極性物質(zhì)，故應(yīng)選擇與之極性相似的毛細(xì)管柱，這樣各組分之間容易分開，峰重疊現(xiàn)象較少，峰形較好。本試驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室情況，選擇以聚乙二醇為固定相的HP-INNOWAX(19091N-133）毛細(xì)管柱。2.1.2程序升溫速率柱溫通常有2種選擇方式：一種為恒溫分析，另一種為程序升溫。有研究報(bào)道，程序升溫分析在分離效果和靈敏度兩方面都明顯優(yōu)于恒溫分析，而色譜定量的準(zhǔn)確性和可靠性主要取決于色譜峰分離的好壞，因此，本試驗(yàn)采用柱溫程序升溫，初始溫度120℃，終止溫度220℃，并保持2min。隨著升溫速率的增加，測定組分的出峰時(shí)間縮短，但不同組分之間的分離則越來越困難。當(dāng)程序升溫速率由8℃/min升至12℃/min，對VFAs出峰時(shí)間的改變很微小，但對乳酸的出峰時(shí)間變化較明顯（如圖1）。鑒于保證各組分的分離效果，將程序升溫的速率設(shè)定為10℃/min（如圖2）。2.1.3乳酸的出峰時(shí)間升溫速率固定在10℃/min，載氣壓力分別為130、140、150、160、170kPa和180kPa時(shí)進(jìn)樣測定出峰時(shí)間和效果。載氣壓力與出峰時(shí)間的關(guān)系如圖3，當(dāng)載氣由130kPa升至180kPa時(shí)，乳酸的出峰時(shí)間有所縮短，其余組分變化微小。試驗(yàn)結(jié)果顯示，出峰時(shí)間會(huì)隨載氣壓力的增加而縮短，但壓力過大會(huì)導(dǎo)致各組分分離不完全，壓力過小則會(huì)延長分析時(shí)間，由此可選擇既節(jié)省載氣消耗又能縮短每個(gè)樣品的分析時(shí)間的最佳結(jié)合點(diǎn)（即160kPa），實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)高效的原則。2.2乳酸濃度的確定為橫坐標(biāo)，各酸組分與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比（Y）為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸計(jì)算，得到回歸方程：Y乙=2.3042X+0.0318,R=0.9986;Y丙=1.4397X-0.0281,R=0.9928;Y丁=1.1441X-0.0602,R=0.9971;Y乳=2.6108X+1.7726,R=0.9907。由以上方程可知，乙、丙、丁酸濃度在2～10mmol/L時(shí)，乳酸濃度在12～60mmol/L時(shí)，線性關(guān)系良好。同時(shí)，通過氣相色譜儀可得本方法乙酸、丙酸、丁酸和乳酸的最小檢測濃度分別為0.127、0.087、0.075mmol/L和0.665mmol/L。2.3測定校正因子取配制好的對照品溶液A、B、C，分別按照選擇好的色譜條件進(jìn)行測定，進(jìn)樣2μL，每個(gè)溶液平行進(jìn)樣3次，計(jì)算校正因子，并求平均數(shù)：式中，As為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積，Ai為對照品的峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液的濃度，Ci為對照品溶液的濃度。2.4回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差取待測溶液A、B，按2.2中方法測定乙、丙、丁、乳酸的含量，重復(fù)10次，由相對校正因子計(jì)算其回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。從表3中可知，2種不同濃度待測液中乙、丙、丁、乳酸的回收率均在95%以上，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.44%～1.88%，精確度和可信度均較高。2.5精密度和準(zhǔn)確度為了提高本方法的實(shí)際應(yīng)用性，試驗(yàn)也選取青貯玉米鮮樣進(jìn)行測定。取制備好的樣品上清液及加入標(biāo)品后溶液上機(jī)分析，分別重復(fù)測定10次，其精密度及回收率見表4。結(jié)果顯示，此方法中青貯料樣品的回收率也達(dá)到93%以上，但比待測標(biāo)液要低一點(diǎn)，而相對標(biāo)準(zhǔn)偏差雖然控制在2.46%以下，重復(fù)性卻沒有待測標(biāo)液的好，可能是因?yàn)榍噘A玉米沒有經(jīng)過衍生化處理，含有的雜質(zhì)對結(jié)果有一定影響。3衍生化處理后樣品的測定本試驗(yàn)采用毛細(xì)管柱氣相色譜儀，通過對柱溫升溫程序、載氣壓力及氣化室、檢測室溫度等一系列色譜條件進(jìn)行探究，建立了無需任何預(yù)處理同時(shí)測定揮發(fā)性脂肪酸和乳酸的方法。目前報(bào)道的有機(jī)酸測定方法中，樣品大都要經(jīng)過非常復(fù)雜的酯化預(yù)處理或加酸酸化后才能進(jìn)樣。常影等對乳酸進(jìn)行衍生化處理后測定其含量，回收率為96.15%～108.27%，相對偏差為0.84%～4.07%；林秋萍等利用高碘酸將乳酸氧化為乙醛后進(jìn)樣，回收率在78.2%～95.6%之間，標(biāo)準(zhǔn)偏差高達(dá)7.9%。本試驗(yàn)采用的方法無需對乳酸進(jìn)行預(yù)處理，標(biāo)準(zhǔn)液和青貯玉米的回收率分別在95.63%～98.97%、93.71%～97.54%，兩者的相對偏差也控制在較低水平，均好于上述兩種測定，這證明此方法在實(shí)際測定青貯料的品質(zhì)時(shí)是方便可行的，也是非常實(shí)用的。另外