人白介素6IL6ELISA試劑盒

人白介素6(IL-6)ELISA試劑盒適用于體外定量檢測人血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清液和組織等樣品中天然或重組的人白介素6(IL-6)濃度。如需檢測其它特殊樣本請咨詢我公司。使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑盒組分。檢測原理人白介素6(IL-6)ELISA試劑盒是典型的夾心法酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA），采用雙抗體夾心ELISA法。預先包被的抗體為白介素6(IL-6)單克隆抗體，檢測相抗體為多克隆抗體，經(jīng)生物素（biotin）標記。樣品和生物素標記抗體先后加入酶標板孔反應后，經(jīng)PBS或TBS洗滌，隨后加入過氧化物酶標記的親和素反應；經(jīng)過PBS或TBS的徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測因子呈正相關。試劑盒組成酶標板、標準品、濃縮生物素化抗體、濃縮酶結合物(ABC)、酶結合物(ABC)稀釋液、抗體稀釋液、標準品稀釋液、樣品稀釋液、濃縮洗滌液(25×)、顯色劑A、顯色劑B、終止液需自備物品1.酶標儀(450nm檢測波長濾光片，570nm或630nm校正波長濾光片)；2.洗板機（可調(diào)注液量，保證每孔350靗洗液而不溢出）；3.高精度單道加液器（量程為0.5-10靗,2-20靗,20-200靗,200-1000靗)；4.高精度多道加液器（8道或12道，量程為50-300靗)；5.37℃恒溫箱；6.低溫離心機；7.純凈水或蒸餾水。標本收集注意事項1.收集血液的試管應為一次性的無熱原、無內(nèi)毒素試管；2.血清和血漿避免使用溶血、高血脂標本；3.標本應清澈透明，懸浮物應離心去除；4.標本收集后若不及時檢測，需按一次使用量分裝，凍存于-20℃，-80℃冰箱內(nèi)，避免反復凍融；5.可根據(jù)標本的實際情況，做適當倍數(shù)稀釋(建議做預實驗，以確定稀釋倍數(shù))；6.收集標本，盡量做到雙份的用量，避免一次實驗失敗，重復實驗時標本缺失，從而耽誤實驗進程；7.收集標本時，應該做好防護措施（比如戴手套，口罩，護目鏡等），因為所有標本都具有一定的潛在危險性；8.樣本處理應該在生物安全柜里面，并且正確使用生物安全柜。標本處理1.血清：將采集的全血靜置冰箱4℃過夜，然后1000-3000rpm離心10分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3個月）或-80℃（3-6個月）保存；2.血漿：用EDTA，枸櫞酸鈉，肝素等作為抗凝劑，加入血液混勻后，1000-3000rpm離心10分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3個月）或-80℃（3-6個月）保存；3.組織勻漿：切取組織塊，0.01MPBS中過洗一次；按照1G組織加入5-10ml組織蛋白萃取試劑的比例，在冰水中勻漿。勻漿完成后，5000-10000rpm離心10分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3個月）或-80℃（3-6個月）保存；4.細胞培養(yǎng)上清：1000-3000rpm離心10分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3個月）或-80℃（3-6個月）保存；5.尿液，腹水，腦脊液等：1000-3000rpm離心10分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3個月）或-80℃3-6個月）保存；注樣品稀釋的一般原則用戶須查閱相關文獻了解標本內(nèi)待測因子的含量，決定適當?shù)南♂尡稊?shù)，以使稀釋后樣品中待測因子的濃度處于ELISA試劑盒的最佳檢測范圍。樣品的稀釋應有詳細記錄。注意事項1．試劑盒使用前請保存在2-8℃。除復溶后的標準品，其他成分不可凍結；2．濃縮生物素化抗體、濃縮酶結合物體積小，運輸中顛簸和可能的倒置，會使液體沾到管壁或瓶蓋。因此使用前請用手甩幾下或1000rpm離心1分鐘，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底；3．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，使結晶完全溶解后再配制洗滌液；4．實驗過程中，凍干標準品為一次性使用，不得分裝。因其濃度較低，溶解兩小時候后，會迅速失活；5．操作嚴格按照說明書進行，本試劑不同批號組分不得混用；6．配制試劑時，要用旋渦混合儀混勻。加入孔內(nèi)的試劑，充分混勻對測試結果尤為重要，最好使用微量振蕩器(使用最低頻率)，如無微量振蕩器，可在反應前手工輕輕晃動酶標板1分鐘，例如做圓周動作，使加入孔中的反應液混勻；7．實驗用酶標儀應嚴格按使用說明書規(guī)范操作，并在使用前充分預熱；8．ELISA實驗中標準品和樣本檢測時建議作復孔；9．應將未用的酶標板放回原鋁箔袋中，置2-8℃保存；10．顯色液對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下；11．超過使用有效日期的試劑盒不能應用于實驗中；12．試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準，使用雙波長檢測時，波長應該設置為450nm和630nm；13．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按生物廢棄物處理。終止液為2M硫酸，使用時必須注意安全；14．各步驟加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校準其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣；15．每次試驗測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔最高濃度的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（×n）；16．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性；17．以洗板機洗板時,每孔注液量不應少于350靗,注意檢查加樣頭是否堵塞。手工洗板時,用帶紙屑的吸水材料應慎重,防止外源性過氧化物酶類似物或氧化還原物與顯色劑發(fā)生反應；18．用終止液終止反應后，請于10分鐘內(nèi)讀取OD值；19．進行復孔實驗時，結果計算一定要求平均值；20．標本溶血可能會有假陽性結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測；21．實驗時，應該將加過樣品的板條放于密閉盒內(nèi)，并保持濕度約60%左右；22．為保證恒溫箱內(nèi)的溫度為37℃，恒溫箱的溫度要經(jīng)常校準。以確保實驗溫度保持恒定；準備工作1.請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫后方可進行試驗；2.將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回；3.標準品:加入標準品稀釋液1.0ml至凍干標準品中，靜置10分鐘，待其充分溶解后，輕輕混勻，之后在管身標注①，然后根據(jù)需要進行稀釋注意：務必要保證凍干標準品徹底溶解和混勻。4.標準品稀釋方法：取7支潔凈的試劑管，分別標注②,③,④,⑤,⑥,⑦,⑧.每管加入300靗標準品稀釋液。從第①管內(nèi)取出300靗加入到第②管，混勻后，再從第②管取出300靗加入到第③管，以此類推至第⑦管。第⑧管為標準品稀釋液，作為陰性對照使用。5.生物素化抗體工作液：按當次試驗所需用量，用抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)，配置成生物素化抗體工作液。使用前30分鐘準備，僅供當日使用；6.酶結合物工作液：按當次試驗所需要用量，用酶結合物稀釋液稀釋濃縮酶結合物(1:100)，配置成酶結合物工作液。使用前30分鐘準備，僅供當日使用；7.TMB顯色工作液：在使用之前30分鐘，按TMB顯色液Ax9份加TMB顯色液Bx1份（9：1）的比例配制TMB顯色工作液。洗滌方法1.自動洗板機：要求注入的洗滌液為350靗，注入與吸出間隔20－30秒。確保機器運用熟練后，再投入實驗中使用；2.手工洗板：每孔加洗滌液350靗，靜置30秒后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干。手工洗板時，注意加入洗液的過程中，不要造成孔間污染，從而出現(xiàn)跳孔的現(xiàn)象。操作步驟1.從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條，未用的板條和干燥劑請放回鋁箔袋內(nèi)封存于2-8℃；2.預留空白孔（若使用雙波長讀板，空白孔可以不設）；3.分別將標本或不同濃度的標準品（0ng/mL孔加標準品稀釋液）加入相應孔中(100靗/孔)，37℃孵箱孵育90分鐘；4.提前30分鐘制備生物素化抗體工作液；5.洗板2次；6.加入生物素化抗體工作液(100靗/孔)，37℃孵箱孵育60分鐘；7.提前30分鐘制備酶結合物工作液。室溫避光放置；8.洗板3次；9.除空白孔外，加入酶結合物工作液(100靗/孔)。37℃孵箱，避光孵育30分鐘；10.洗板5次；11.加入TMB顯色工作液（包括空白孔）100靗/孔，37℃孵箱，避光孵育，當標準曲線高濃度的顏色較深，有明顯的顏色梯度的時候，即可終止。試驗顯色反應請勿超過30分鐘；12.加入終止液（包括空白孔）100靗/孔，混勻后即刻測量OD（450nm）值(10分鐘內(nèi))。結果判斷1．每個標準品和標本的OD值應減去零孔的OD值（若不減零孔值，標準曲線的零孔應相交于Y軸）；2．手工繪制標準曲線：以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析，如curveexpert1.3進行結果計算；3．若標本