南方醫(yī)科大學

PAGE南方醫(yī)科大學教案2006—2007學年春季學期所在單位藥學院系、教研室藥物化學課程名稱天然藥物化學授課對象2004級藥學專業(yè)本科生授課教師謝揚職稱副教授教材名稱天然藥物化學教案首頁授課題目第二章糖和苷（4）授課形式講授授課時間2007.3.27授課學時2教學目的與要求1、糖的13CNMR與的1HNMR性質

2、熟悉糖鏈的結構測定基本內容1、過碘酸裂解反應2、糖醛酸苷的選擇性水解反應3、糖的1HNMR的性質4、糖的13CNMR的性質5、糖鏈結構的測定重點難點糖的13CNMR的性質（重點）2、糖的13CNMR的性質（難點）主要教學媒體主要外語詞匯glycosidationshift.matrixasistedlaserdesorptionionization(MALDI-MS)matrixasistedlaserdesorptionionization/timeofflight(MALDI-TOF-MS).有關本內容的新進展主要參考資料或相關網站《天然藥物化學學習指導》(人民衛(wèi)生出版社)，吳繼洲主編。系、教研室審查意見課后體會教學過程教學內容時間分配和媒體選擇五、過碘酸裂解反應法（Smith降解法）1、特點：①反應條件溫和、易得到原苷元（除酶解法外，其它方法可能得到的是次級苷元）；②通過反應產物可推測糖的種類；③通過反應產物可推測糖與糖的連接方式以及氧環(huán)的大小。2、反應試劑：過碘酸鈉（NaIO4）與四氫硼鈉（NaBH4）3、反應過程：分為三步，①先將樣品溶于水或稀醇溶液中，加入過碘酸鈉，在室溫下將糖氧化開裂成二醛；②然后用NaBH4將醛還原成伯醇；③最后調節(jié)pH=2左右，室溫下放置即可讓其水解。4、舉例：人參皂苷Rb1使用各種方法均得不到原苷元，只有采用smith降解法后才得到了人參皂苷Rb1的“真正”原苷元—20-S-原人參二醇?！?0-S-原人參二醇實際上含有三個羥基，期所以稱為原人參二醇，是因為該苷元與以前采用其他方法使人參皂苷Rb1水解后得出的所謂“原苷元”有區(qū)別。人參皂苷Rb1所謂的“原苷元”，其結構中含兩個羥基—被稱為人參二醇，它過去一直被人們誤認為是人參皂苷Rb1的原苷元，其實這個人參二醇是一個人工產物，并非真正的原苷元。人參皂苷Rb1真正的原苷元應該是對人參皂苷Rb1采用smith降解法后所得出的產物（含三個羥基！）。為了與誤認的產物相區(qū)別，我們現(xiàn)在將人參皂苷Rb1真正的原苷元命名為原人參二醇，加了一個“原”字。5、C-苷類是很難用酸催化水解的，如用smith降解法將獲得連有一個醛基的苷元?！鵆-苷類尚可用FeCl3氧化法開裂苷鍵，但所得游離糖往往在C1-C2間開裂。例如葡萄糖C-苷用FeCl3氧化法開裂苷鍵后，得到的糖是阿拉伯糖。6、smith降解法的適用范圍：①特別適合于那些苷元不穩(wěn)定的苷與C-苷的裂解。②對于那些苷元上有鄰二醇羥基以及有易被氧化基團的苷，本法不能應用（因為過碘酸在氧化糖的同時會將它們一起氧化）。7、說明：①smith降解法中第二步是為了防止新生成的醛與醇進一步縮合，故將醛還原成伯醇。②smith降解法中第三步其所以能在非常弱的酸性條件下進行水解，是因為第二步中生成的醇中間體具有真正的縮醛結構，比苷的環(huán)狀縮醛更容易被稀酸水解。教學過程教學內容時間分配和媒體選擇20（S）人參二醇或20（R）人參二醇20（R）次皂苷20（S）原人參二醇HOAc①HCl20（S）人參二醇或20（R）人參二醇20（R）次皂苷20（S）原人參二醇HOAc①HCl②t-BuO-③H+①IO4-②BH4-③H+※人參皂苷Rb1在不同條件下的水解產物※C苷Smith裂解過程六、糖醛酸苷的選擇性水解反應1、糖醛酸苷的存在：許多苷與聚糖中都含有糖醛酸，特別是皂苷與生物體內肝臟的代謝產物中糖醛酸苷更為常見。2、糖醛酸苷鍵：很難被普通裂解方法開裂，需要采用特殊的選擇性水解反應，例如：紫外光照射法、四醋酸鉛分解法、醋酐-吡啶分解法、微生物培養(yǎng)法等。3、值得注意的是：有些苷鍵極不穩(wěn)定，在較弱的酸性或在水或稀醇液中稍長時間加熱即能水解。而有些苷鍵則很難開裂。因此，在保存苷時，要注意環(huán)境，防止水解。教學過程教學內容時間分配和媒體選擇第五節(jié)糖的核磁共振性質概述：核磁共振在解決糖及其苷類化合物的苷鍵構型、氧環(huán)大小、優(yōu)勢構象、糖的種類、糖與糖的連接位置以及糖與糖的連接順序等方面具有重要的作用。一、糖的1HNMR性質1、在糖的1HNMR譜中，糖的端基質子信號在δ5.0ppm附近，多數(shù)呈現(xiàn)特征性的雙峰，少數(shù)呈現(xiàn)寬單峰，由于端基質子區(qū)信號較少，故糖的端基質子信號容易辨認和解析。2、糖環(huán)質子信號在δ3.5—δ4.5ppm之間。3、甲基五碳糖（如鼠李糖）的甲基質子信號在δ1.0ppm附近.4、糖的C1-H與C2-H的偶合常數(shù)，被廣泛應用于端基碳原子構型的判斷。①對于絕大多數(shù)的D-吡喃糖（如葡萄糖），當C1-OH處于橫鍵上（代表β-苷鍵），C1-H與C2-H的偶合常數(shù)J=6—8Hz;當C1-OH處于豎鍵上（代表α-苷鍵），C1-H與C2-H的偶合常數(shù)J=2—4Hz。如此可區(qū)別α-異構體與β-異構體。②原因分析：質子的偶合常數(shù)與兩面角有關，對于β-異構體，在吡喃環(huán)的優(yōu)勢構象C1式中，C1-H與C2-H兩個質子均處于豎鍵上，其兩面角為180°，偶合常數(shù)J=6—8Hz。相反，對于α-異構體，在吡喃環(huán)的優(yōu)勢構象C1式中，C1-H處于橫鍵上，C2-H依然處于豎鍵上，其兩面角為60°，偶合常數(shù)J=2—4Hz?！鵆2-H始終處于豎鍵上是進行以上判斷的前提。③對于甘露糖與鼠李糖，雖然具有吡喃環(huán)結構，但是其C2-H都處于橫鍵上，故無法采用葡萄糖類似方法來判斷它們的苷鍵構型。5、通常，α-苷鍵端基質子信號的化學位移>5.0ppm;β-苷鍵端基質子信號的化學位移<5.0ppm.6、低聚糖與多糖的1HNMR譜通常在D2O中測定，故不必考慮-OH峰。如果存在HDO的殘峰，也可以通過改變溫度的方法解決此問題（溫度升高，HDO的化學位移向高場移動）。教學過程教學內容時間分配和媒體選擇7、對于呋喃型糖，無論其端基質子和C2-H是處于反式還是順式，其質子間的偶合常數(shù)變化都不大，所以無法利用端基質子的偶合常數(shù)來判斷它們的苷鍵構型。二、糖的13CNMR性質因為化學位移范圍寬，信號清楚，因此碳譜不但能確認多糖中各種碳核，也能分辨分子的構型與構象，它是研究糖類結構的一種很有效的譜學方法（一）化學位移與偶合常數(shù)1、D-吡喃糖的化學位移值①通常情況C1—α型97~101ppm；β型103~106ppm（端基碳—δ97~106ppm）CH-OH(C2、C3、C4)70~78ppm（參見p88表2-1葡萄糖及苷數(shù)據）CH2-OH(C6)62ppm左右CH3（糖的甲基C）18ppm左右（參見p88表2-1鼠李糖及其苷類）②一般在13C-NMR譜中：2、D-呋喃糖的化學位移值CH2-OH(C1)64ppm左右CH-OH（C3、C5）>80ppm（明顯偏大?。┙虒W過程教學內容時間分配和媒體選擇3、13C①依據95~105ppm區(qū)域13C信號的個數(shù)可判斷低聚糖及其苷中所含糖的個數(shù)（因為在全氫去偶碳譜中，每一個不等性的端基13C原子都是一個獨立的單峰）。②若95~105ppm區(qū)域端基13C信號在大于100ppm區(qū)域，則苷鍵構型為β-D或α-L；若95~105ppm區(qū)域端基13C信號在小于100ppm區(qū)域，則苷鍵構型為α-D或β因此，依據95~105ppm區(qū)域13C③因為吡喃糖與呋喃糖的C3或C5信號的化學位移有明顯差異（前者多大于80ppm,后者多小于78ppm）,所以依據13C譜數(shù)據尚可判斷氧環(huán)的大小。4、吡喃糖中端基碳的C-H偶合常數(shù)（1JC1-H1）可用于苷鍵構型的確定對于D-吡喃糖：α苷鍵JC-H≈170Hz；β-苷鍵JC-H≈160Hz。例如：α-D-甘露糖1JC1-H1=166ppm;β-D-甘露糖1JC1-H1=156ppm對于L-吡喃糖：β苷鍵JC-H≈170Hz；α-苷鍵JC-H≈160Hz。鼠李糖的優(yōu)勢構象是1C式，其1JC1-H1值與常規(guī)L-吡喃糖不同，分別為：α-L-鼠李糖1JC1-H1=168ppm;β-L-甘露糖1JC1-H1=156ppm5、呋喃型糖苷無法用端基碳與端基質子的偶合常數(shù)來判斷其苷鍵構型（除非采用門控去偶技術）。（二）苷化位移（glycosidationshift，GS）1、定義：糖苷化后，糖的端基碳和苷元的α-C、β-C的化學位移值均發(fā)生了改變，這種苷化前后的化學位移的變化現(xiàn)象，稱為苷化位移。2、苷化位移一般規(guī)律①端基碳、苷元α碳的化學位移值向低場方向移動5～6ppm（+5～+6）單位；②苷元β-碳的化學位移值向高場方向移動3～4ppm（-3～-4）單位；③苷元β位有取代基時的苷化位移規(guī)律：◆苷元α-碳和糖端基碳絕對構型都為R（或S）時，苷化位移規(guī)律同①、②?！糗赵?碳和糖端基碳絕對構型不同時，端基碳和α-碳的苷化位移值比苷元β-位無取代者苷化位移值大約高為3.5ppm單位。教學過程教學內容時間分配和媒體選擇3、酯苷、酚苷的苷化位移：當糖與-OH形成酯苷鍵或酚苷鍵時，其苷化位移值較特殊，端基碳與羰基碳（即苷元α-碳）均向高場位移，β-C向低場位移例如：從下面兩個示例，可以看出醇苷、酯苷和酚苷在成苷后有關碳原子的化學位移變化(在吡啶-d5中測)（在甲醇-d5中測教學過程教學內容時間分配和媒體選擇4、說明：①苷化位移值與苷元的結構有關，與糖的種類無關。②如苷元為鏈狀結構，端基碳的苷化位移值隨著苷元為伯、仲、叔基而遞減，苷元的α-C和β-C變化不大。在被苷化的糖中，通常α-C的位移較大，β-C稍有影響，其他碳則影響不大。三、IR1、以IR譜圖來識別糖的結構，由于區(qū)別較小，各峰較集中，多有重疊，故是很困難的。但也能提供糖的各個官能團、推斷糖苷鍵的構型方面的信息。2、3700～3100cm-1間有明顯的O-H伸縮振動峰。3、如糖分子中含羧基、?；?，則相應官能團的IR吸收峰可見。4、多糖在1500～960cm-1有許多吸收峰，其中970～730cm-1間的峰對判斷端基碳的構形有用。例如：840cm-1為α-L-吡喃糖苷；890cm-1為β-D-吡喃糖苷四、質譜1、糖類難揮發(fā)，且熱不穩(wěn)定，需要制成揮發(fā)性的衍生物才能進行質譜分析。2、糖的立體異構體往往出現(xiàn)幾乎相同的質譜，僅在碎片豐度稍有區(qū)別，所以不能用質譜來區(qū)別糖的構型。3、糖和苷的分子量可用CI（化學電離）、FD-MS、FAB-MS等方法獲得分子離子峰后測出（EI-MS常得不到分子離子峰），這些軟電離方式得到的碎片峰很少，但有可能從分子離子順序失去一個個糖基碎片離子峰，在了解了糖的組成之后，根據質譜的碎片信息來推斷糖鏈的連接順序教學過程教學內容時間分配和媒體選擇第六節(jié)糖鏈的結構測定概述：主要解決四個問題①單糖的組成；②糖的氧環(huán)；③糖與糖之間的連接位置和順序；④苷鍵構型一、糖鏈結構的測定（一）純度測定1、多糖是高分子化合物，其純度與小分子化合物的標準判斷不同。即使是一種多糖純品，其微觀也不均一。2、多糖純品實質上是一定分子量范圍的均一組分。3、多糖純度常用的測定方法①高壓電泳法：最常用※原理：由于中性多糖導電性差、分子量大、在電場中的移動速度慢，常將其制成硼酸絡合物進行高壓電泳?！娪局С煮w：玻璃纖維絲、純絲綢布等?！彌_液：pH=9-12的硼砂溶液?！妷海?0-50V/cm時間：30-120min顯色劑：p-甲氧基苯胺-硫酸。注意：必須使用冷卻系統(tǒng)，將溫度維持在0℃,以免燒壞支持體。②超離心法※原理：由于微粒在離心場中移動的速度與微粒的密度、大小與形狀有關，故將多糖溶液進行密度梯度離心時，如果是組成均一的多糖，則應呈現(xiàn)單峰?！唧w做法：將多糖樣品制成1%-5%的氯化鈉或tris-鹽溶液，接著進行密度梯度離心，待轉速達到恒定后（6000轉/min），采用間隔照明法檢測其是否單峰。③旋光光度法在多糖溶液中加入乙醇使其濃度達到10%左右，離心得沉淀。上清液再用乙醇使其濃度達到20%-25%左右，離心得二次沉淀。比較兩次沉淀的比旋度，如果比旋度相同則為純品，否則為混合物。④其他方法，如凝膠柱色譜、官能團摩爾比恒定法等（自閱）4、注意：要確定一種多糖的均一性，至少要有兩種以上的方法才能確定。（二）分子量測定1、多糖的分子量從幾萬到幾百萬不等，雖然多糖經過提純，但是多糖實際上仍然是大小分子不同的混合物，故所測定的分子量是一種統(tǒng)計平均值。教學過程教學內容時間分配和媒體選擇2、測定多糖分子量物理方法，包括沉降法、光散射法、黏度法和滲透壓法等。凝膠過濾法在實驗室內最常用?！z過濾法介紹：它是根據在凝膠柱上不同分子量的多糖與洗脫體積成一定關系的特性，以一系列結構相似的已知分子量的多糖做標準曲線，從而測定樣品多糖的分子量。該法用量小、操作較簡便。3、MS-目前最常用于單糖、低聚糖及其苷的分子量測定的方法①FD-MS、FAB-MS與電噴霧-MS最常用；②使用EI-MS則需要將糖類物質制備成衍生物（前已敘及）。4、多糖分子量的測定方法目前常采用近年發(fā)展起來的基質輔助激光解析電離質譜（matrixasistedlaserdesorptionionization,MALDI-MS）或基質輔助激光解析飛行時間質譜(matrixasistedlaserdesorptionionization/timeofflight,MALDI-TOF-MS).（三）單糖的鑒定概述：在中草藥成分分離工作中，或在苷和多糖的水解產物中，常常會得到一些單糖成分，須要加以證明。目前發(fā)現(xiàn)新單糖須要進行結構決定的機會較少，多數(shù)工作為進行糖的印證。糖的水溶性很大，且不易獲得結晶，有些物理常數(shù)不易測定，給印證工作帶來困難，以往用化學方法制成衍生物，再作分離鑒定，手續(xù)繁復?，F(xiàn)多采用各種色譜技術，對糖類進行鑒定。1．紙層析①展開系統(tǒng)：常用水飽和的有機溶劑展開，如：正丁醇：醋酸：水（4：1：5上層）BAW正丁醇：乙醇：水（4：1：2.2）BEW②展開方式：上行、下行等③顯色劑：可利用糖的還原性或形成糠醛后引起的一些呈色反應，如：※鄰苯二甲酸苯胺※硝酸銀試劑（使還原糖顯棕黑色）※三苯四氮唑鹽試劑（單糖和還原性低聚糖呈紅色）※3,5-二羥基甲苯鹽酸試劑（酮糖呈紅色）※過碘酸-