基于mdna細(xì)胞色素b序列分析烏骨雞遺傳多樣性及系統(tǒng)進(jìn)化

基于mdna細(xì)胞色素b序列分析烏骨雞遺傳多樣性及系統(tǒng)進(jìn)化

烏骨雞是中國鳥類品種的基因庫中具有特殊經(jīng)濟(jì)價值的寶貴鳥類。由于我國地域遼闊、生態(tài)環(huán)境多樣、選種目標(biāo)和飼養(yǎng)條件不同,再加上一些地域的封閉性,已形成了許多外貌、性能不同的烏骨雞品種。為了能充分開發(fā)利用這一寶貴禽類資源,我國育種工作者針對烏骨雞的遺傳特性和生產(chǎn)性能的改良等方面已經(jīng)開展了大量的研究和實(shí)踐工作。以往關(guān)于烏骨雞特性等相關(guān)的研究主要以RAPD和微衛(wèi)星標(biāo)記為主。目前,以mtDNA序列為分子標(biāo)記運(yùn)用DNA直接測序列的方法研究家禽遺傳多樣性和遺傳分化及起源的研究報道越來越多。而有關(guān)mtDNA分子標(biāo)記系統(tǒng)研究我國烏骨雞的研究報道很少,僅分析了我國很少量的烏骨雞品種的遺傳多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化。本研究運(yùn)用DNA測序技術(shù)直接測定了絲毛烏骨雞、金湖烏雞、江山烏骨雞、余贛烏骨雞、烏蒙烏骨雞、沐川烏骨雞、興文烏骨雞、德化黑雞、鹽津?yàn)豕请u9個烏骨雞品種的mtDNA細(xì)胞色素b基因520bp序列,分析烏骨雞的遺傳多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化,以期為我國烏骨雞的遺傳資源保護(hù)和家雞的起源提供可靠的基礎(chǔ)資料。1血樣、pcr和測序1.1樣本的采集和DNA提取絲毛烏骨雞、金湖烏雞、江山烏骨雞、余贛烏骨雞、烏蒙烏骨雞、沐川烏骨雞、興文烏骨雞、德化黑雞和鹽津?yàn)豕请u9個品種的血樣均采自原產(chǎn)地(公、母比例為3∶4~1∶1),見表1。血樣均以翅靜脈采集,檸檬酸葡萄糖(ACD)抗凝置于5mL指形管中,并保存于-20℃冰箱內(nèi)。采集的血樣采用常規(guī)的酚-氯仿法提取全基因組DNA。1.2DNA擴(kuò)增和序列測定線粒體DNACytb基因擴(kuò)增引物為L15218:5′-CCTATACTATGGCTCCTACCT-3′;H15754:5′-GCTAGTACGCCTCCGAGTTT-3′。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5min;94℃變性45s,51~53℃退火45s,72℃延伸60s,35個循環(huán);72℃延伸10min;4℃保存。PCR產(chǎn)物交上海桑尼生物科技有限公司,采用柱式膠回收試劑盒回收,運(yùn)用ABIPRISM3730測序儀進(jìn)行序列測定。1.3統(tǒng)計分析測序結(jié)果通過Bio-Edit軟件讀取校對,通過Clustalx程序進(jìn)行序列多重比對,用軟件DnaSP4.10.7統(tǒng)計分析其多態(tài)位點(diǎn)、單倍型及其頻率、核苷酸多態(tài)性,用MEGA4.0軟件構(gòu)建了NJ單倍型系統(tǒng)發(fā)生樹,NETWORK4.5.0.1構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖。2烏骨雞系統(tǒng)發(fā)育2.1遺傳多樣性用Dnasp4.10.7軟件分析烏骨雞mtDNA細(xì)胞色素b520bp序列的結(jié)果表明,在品種間和品種內(nèi)未發(fā)現(xiàn)長度變異,堿基變異包括轉(zhuǎn)換和顛換。9個烏骨雞品種堿基T、C、A、G含量分別為24.6%、36.5%、26.2%、12.7%,共發(fā)現(xiàn)16個變異位點(diǎn),其中單一多態(tài)位點(diǎn)8個(96、143、249、291、428、429、457、467),簡約多態(tài)位點(diǎn)8個(77、137、146、155、191、276、399、452),16個變異位點(diǎn)可劃分為13種單倍型(圖1)。如表2所示,9個烏雞品種中單倍型比例最高的是金湖烏雞(50%),最低的是鹽津?yàn)豕请u(14.286%);單倍型多樣度為0~0.78571;核苷酸多樣度為0~0.00399;金湖烏雞的單倍型、核苷酸多樣度最豐富;依次是江山烏骨雞、余贛烏骨雞、烏蒙烏骨雞、絲毛烏骨雞、沐川烏骨雞、興文烏骨雞、德化黑雞和鹽津?yàn)豕请u的單倍型、核苷酸多樣度最小。2.2烏骨雞系統(tǒng)發(fā)育本研究選擇GenBank上與所測的mtDNACytb序列相一致的4種原雞序列。紅色原雞3個亞種,它們分別是分布于印度支那半島、泰國和蘇門答臘的G.g.gallus1(AP003322)和G.g.gallus2(AB044986),分布于印度尼西亞爪哇島的G.g.bankiva1(AP003323)和G.g.bankiva1(AB0044985),分布于中國云南西部、西南部、印度支那半島、緬甸和馬來西亞北部的G.g.spadiceus1(AB044987)和G.g.spadiceus2(AP003321);其他3種原雞分別是黑尾原雞G.lafayettei1(AB044990)和G.lafayettei2(AP003325)、灰紋原雞G.sonneratti1(AB044989)和G.sonneratti2(AP006741)、綠頸原雞G.varius1(AB044988)和G.varius2(AP003324)?；诒狙芯繙y得的71條烏骨雞序列和以上原雞序列,用Dnasp4.10.3軟件分析得到9個烏骨雞品種和原雞共有24種單倍型;構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)生樹(圖2);見圖3表明,大部分烏骨雞的單倍型都與3種紅原雞歸為一大類或遺傳關(guān)系很近,而H4(YG3、JH3)、H5(JH1)、H8(MC1)與H21(G.sonneratti1)灰紋原雞首先聚為一小類,再與其余烏骨雞及紅色原雞聚為一大類,推斷這9個烏骨雞主要的母系起源為3種紅色原雞亞種,可能還含有少量的紋原雞血緣。3不同品種雞的起源及其起源遺傳多樣性一般是指種內(nèi)不同群體之間或同一群體內(nèi)不同個體的遺傳變異。衡量一個品種(群體)mtDNA變異程度的主要指標(biāo)是單倍型多樣度(Hd)和核苷酸多樣度(Pi)。Hd和Pi值越大,群體的多態(tài)豐富程度越高,其遺傳多樣性越豐富。本研究中金湖烏雞單倍型、核苷酸多樣度最豐富;依次是江山烏骨雞、余贛烏骨雞、烏蒙烏骨雞、絲毛烏骨雞、沐川烏骨雞、興文烏骨雞、德化黑雞、鹽津?yàn)豕请u單倍型、核苷酸多樣度最小;在這9個烏骨雞品種中,金湖烏雞遺傳多樣性最豐富,鹽津?yàn)豕请u遺傳多樣性不豐富。而湯青萍等運(yùn)用微衛(wèi)星標(biāo)記(SSR)研究我國主要烏骨雞品種的遺傳多樣性的結(jié)果顯示,鹽津?yàn)豕请u在12個烏骨雞品種中遺傳多樣性最豐富,而金湖烏雞遺傳多樣性相對較低,與本研究結(jié)果不一致。究其原因可能與mtDNA屬于細(xì)胞核外遺傳標(biāo)記,而微衛(wèi)星標(biāo)記屬于核內(nèi)標(biāo)記反應(yīng)的遺傳信息不一致有關(guān)。為了從分子水平準(zhǔn)確評價畜禽遺傳多樣性,必須增強(qiáng)分子標(biāo)記評價的可靠性檢驗(yàn)以及利用多種分子標(biāo)記綜合評價得出更加準(zhǔn)確、全面和科學(xué)的研究結(jié)果,指導(dǎo)遺傳資源的保護(hù)和利用。自19世紀(jì)達(dá)爾文認(rèn)為紅色原雞是所有家雞的唯一祖先、多元論學(xué)者認(rèn)為紅色原雞是家雞的主要祖先以來,國內(nèi)外有關(guān)家雞起源的問題一直未有最終的定論。Frisby等認(rèn)為,紅色原雞很可能是家雞的唯一祖先。而程光潮等用血型蛋白多態(tài)和DNA指紋等方法進(jìn)行研究,認(rèn)為中國地方雞可能有獨(dú)立的血緣來源。Fumihito等用線粒體DNA證據(jù)證明紅色原雞是家雞的唯一祖先,并且還認(rèn)為紅色原雞亞種實(shí)際上可以分為海島型和大陸型2個類型,其中的大陸型是所有家雞的共同祖先。而近幾年國內(nèi)學(xué)者的研究表明,我國家雞起源于多個紅色原雞亞種。Niu等對我國6個地方雞品種的線粒體DNA的研究表明,浙江省的5個地方雞種至少有2個母系起源。Liu等研究認(rèn)為,我國家雞有5個母系起源,分別來自Gallusgallusgallus亞種和Gallusgallusspadiceus亞種,而歐亞大陸家雞起源于亞洲的南部和東南部,同樣有多個母系起源,紅色原雞在中國的馴化是多次、多地的,是人類長期選擇的結(jié)果。宋春紅等研究表明,文昌雞、魯西斗雞、壽光雞、濟(jì)寧百日雞、萊蕪黑雞和瑯琊雞等6個地方品種雞的母系可能起源于云南、老撾等地紅色原雞的3個大陸亞種。朱文奇等研究表明,我國斗雞起源于多個紅色原雞亞種,并經(jīng)受了多次的獨(dú)立馴化。貢潘偏抽等報道,瓢雞在遺傳組成上具有5個母系血統(tǒng)來源。劉麗仙等等報道,化坪烏骨雞具有6個母系起源。目前,利用線粒體DNA分析家雞的起源研究的結(jié)果來看,仍然存在一定分歧。但是根據(jù)以上研究報道并結(jié)合本研究結(jié)果,可以肯定家雞肯定不是單一的起源于紅色原雞,我國不同家雞品種(群體)有其不同的起源和特殊的演化歷史,不能一概而論;另外,Erksson等根據(jù)家雞、原雞表型皮膚顏色觀察及與黃皮膚相關(guān)的BCDO2基因的進(jìn)化分析,表明大部分家雞的血統(tǒng)里摻雜了灰紋原雞的血緣。而本研究亦表明,我國烏骨雞主要的母系起源為3種紅色原雞亞種,可能還含有少量的灰紋原雞血緣,這說明我國家雞的起源問題可能較為復(fù)雜。因此,本研究認(rèn)為我國烏骨雞的起源和系統(tǒng)進(jìn)