中藥中農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法的研究

中藥中農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法的研究

中藥來(lái)自天然植物。隨著世界環(huán)境的惡化，殘余重金屬和農(nóng)藥問(wèn)題已成為影響其安全性的重要因素之一。殘留重金屬元素的毒性作用主要表現(xiàn)為慢性蓄積性中毒,它們與人體內(nèi)酶蛋白上的-SH和-S-S-鍵牢固結(jié)合,從而使蛋白質(zhì)變性,酶失去活性,組織細(xì)胞出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能上的損害。中藥制劑中重金屬可能來(lái)源于中藥材,輔料,提取溶媒,設(shè)備及接觸器皿等。農(nóng)藥對(duì)人體的危害主要表現(xiàn)為神經(jīng)毒性:有機(jī)氯農(nóng)藥易產(chǎn)生慢性中毒;有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)乙酰膽堿酯酶有抑制作用,它們易產(chǎn)生急性中毒,有時(shí)嚴(yán)重危及生命;菊酯類農(nóng)藥對(duì)呼吸道可造成嚴(yán)重刺激,引起過(guò)敏性咳嗽及哮喘,對(duì)孕婦及兒童可引起類中毒反應(yīng)。中藥制劑中的農(nóng)藥殘留主要原因是農(nóng)藥的不規(guī)范使用,也有些農(nóng)藥雖早已被禁用,但由于其不易分解,在土壤中長(zhǎng)期殘留,也會(huì)對(duì)中藥材造成污染,中藥材在倉(cāng)儲(chǔ)過(guò)程中為了防蟲(chóng)蛀而噴灑農(nóng)藥也可能成為重要的污染途徑。近年來(lái),中藥中有害殘留問(wèn)題引起了越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)學(xué)者的關(guān)注,但有關(guān)中成藥中農(nóng)藥殘留量檢測(cè)的研究報(bào)道較少。作者采用原子吸收分光光度法和原子熒光法測(cè)定了同仁烏雞白鳳丸中鉛、鎘、銅、砷、汞的含量,采用氣相色譜法和氣質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定了其中9種有機(jī)氯、12種有機(jī)磷和3種擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥的殘留量,為其全面質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1試劑與標(biāo)準(zhǔn)品Mars5微波消解儀(CEM公司),AFS-9130雙道原子熒光光度計(jì)(北京吉天儀器有限公司),SOLAARM6原子吸收光譜儀(Thermo公司),島津GC2010氣相色譜儀(帶ECD檢測(cè)器),島津GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,TraceGC氣相色譜儀(帶FPD檢測(cè)器,Thermo公司),METTLERAE240電子天平,N-EVAP111氮吹儀,中華牌加熱器(河南鞏義市英峪儀器廠)。分析純氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉、硫酸、磷酸二氫銨、硝酸鎂、碘化鉀、抗壞血酸、鹽酸羥胺、硼氫化鈉、氫氧化鈉、高錳酸鉀、中性氧化鋁(北京化學(xué)試劑公司),分析純石油醚(60～90℃)、乙醚(北京化學(xué)試劑公司,重蒸餾后使用),優(yōu)級(jí)純硝酸、硫酸(北京化工廠),BV-Ⅲ級(jí)硝酸(北京化學(xué)試劑研究所),PR級(jí)正己烷、醋酸乙酯、丙酮、二氯甲烷(DIKMA公司),活性炭小柱(Supelclean公司),弗羅里硅土(PR級(jí),60/100目,活化后含水2%,Alltech公司),柱色譜用微晶纖維素粉(Serva公司),水為超純水。鉛、鎘、砷、汞、銅單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液,α-BHC,PCNB,γ-BHC,β-BHC,δ-BHC,PP′-DDE,OP′-DDT,PP′-DDD,PP′-DDT,甲胺磷、敵敵畏、乙酰甲胺磷、氧化樂(lè)果、久效磷、樂(lè)果、二嗪磷、甲基對(duì)硫磷、馬拉硫磷、對(duì)硫磷、殺撲磷、乙硫磷,氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。同仁烏雞白鳳丸10批,由北京同仁堂股份有限公司北京同仁堂制藥廠提供。2方法和結(jié)果2.1根據(jù)同益烏豐丸中重金屬殘留量的測(cè)定2.1.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的制備將各單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液用2%硝酸溶液稀釋成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)貯備液,于低溫保存,臨用前稀釋并制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.1.2微波消解儀消解取同仁烏雞白鳳丸,研細(xì),精密稱取0.5g于聚四氟乙烯消解罐中,加硝酸5.00mL,混勻,蓋好內(nèi)蓋,旋緊外套,置Mars5微波消解儀內(nèi)按以下程序消解:第1步:溫度3min內(nèi)從室溫升至110℃,保持3min;第2步:溫度3min內(nèi)從110℃升至150℃,保持3min;第3步:溫度3min內(nèi)從150℃升至180℃,保持9min。消解完畢后,使消解罐自然冷卻至室溫,置電熱板上120℃加熱至紅棕色蒸氣揮盡,并繼續(xù)濃縮至約2～3mL,放冷,用水轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中,并稀釋至刻度,即得供試品溶液。2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制照《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄ⅨB“砷、鎘、鉛、汞、銅測(cè)定法”分別測(cè)定了同仁烏雞白鳳丸中鉛、鎘、銅的含量,其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程依次為Y=-0.000008X2+0.00351X+0.0040,r=0.9988;Y=-0.001947X2+0.05915X+0.0062,r=1.0000;Y=-0.009935X2+0.11778X+0.0006,r=0.9997,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。2.1.4測(cè)量汞的測(cè)定原子熒光法2.1.4.還原劑的制備檢測(cè)波長(zhǎng)253.6nm,空心陰極燈工作電流為60mA,以含0.2%硼氫化鈉和0.2%氫氧化鈉的混合溶液(臨用前現(xiàn)配)作為還原劑,鹽酸溶液(1～100)為載液,高純氬為載氣。2.1.4.鹽酸羥胺溶液配制精密量取汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100ng·mL-1)1mL,置100mL量瓶中,加20%硫酸溶液20mL,5%高錳酸鉀溶液0.5mL,搖勻,滴加5%鹽酸羥胺溶液至紫紅色恰好消失,加水稀釋至刻度,搖勻。儀器自動(dòng)配置標(biāo)準(zhǔn)曲線,濃度分別為0,0.1,0.3,0.5,0.7,1.0ng·mL-1,測(cè)定熒光強(qiáng)度,以熒光值為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其回歸方程為Y=0.0034X+0.0070,r=0.9997。2.1.4.鹽酸羥胺溶液精密量取供試品溶液2mL,置10mL比色管中,加20%硫酸2mL,5%高錳酸鉀溶液0.1mL,搖勻,滴加5%鹽酸羥胺溶液至紫紅色恰好消失,加水稀釋至刻度,搖勻。照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下方法測(cè)定熒光值,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品中汞的含量,計(jì)算,即得,結(jié)果見(jiàn)表1。2.1.5測(cè)定硫逆光的測(cè)定原子燈光法2.1.5.還原劑溶液配制檢測(cè)波長(zhǎng)193.7nm,空心陰極燈工作電流為60mA,以含1%硼氫化鈉和0.3%氫氧化鈉的混合溶液作為還原劑,鹽酸溶液(1～100)為載液,高純氬為載氣。2.1.5.對(duì)照品溶液的制備精密量取砷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1μg·mL-1)5mL,用2%硝酸溶液稀釋至100mL。精密量取5mL,加25%碘化鉀溶液(臨用前現(xiàn)配)1mL,搖勻,加10%抗壞血酸溶液(臨用前現(xiàn)配)1mL,搖勻,用鹽酸溶液(20～100)稀釋至25mL,搖勻,作為對(duì)照品溶液(10ng·mL-1)。儀器自動(dòng)配置標(biāo)準(zhǔn)曲線,質(zhì)量濃度分別為0,1,3,5,7,10ng·mL-1,測(cè)定熒光強(qiáng)度值,以熒光值為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其回歸方程為Y=0.0162X+0.2807,r=0.9978。2.1.5.樣品含量測(cè)定精密量取供試品溶液5mL,照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下,自“加25%碘化鉀溶液1mL起”,依法測(cè)定,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品中砷的含量,計(jì)算,即得,結(jié)果見(jiàn)表1。2.2結(jié)果表明，烏豐丸中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量2.2.1ecd設(shè)備進(jìn)樣EQYUTY-1701彈性石英毛細(xì)管柱(0.25μm×0.25mm×30m),柱升溫程序:初始溫度60℃,以60℃·min-1升至180℃,再以5℃·min-1升至210℃,保持10min,以15℃·min-1升至250℃,保持5min,進(jìn)樣口溫度220℃,不分流進(jìn)樣,ECD檢測(cè)器溫度300℃,載氣高純氮,柱流速1.48mL·min-1,吹掃氣流速3mL·min-1,進(jìn)樣量1.0μL。有機(jī)氯對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見(jiàn)圖1。2.2.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的測(cè)定結(jié)果取同仁烏雞白鳳丸,研細(xì),精密稱取2g,照《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄ⅨQ“農(nóng)藥殘留量測(cè)定法”測(cè)定了9種有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留量,結(jié)果部分樣品中檢出α-BHC,β-BHC,δ-BHC,PP′-DDE,其余有機(jī)氯類農(nóng)藥均未檢出,標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和測(cè)定結(jié)果分別見(jiàn)表2,3。為保證含量測(cè)定的可靠性,隨行制備了加樣回收樣品,取供試品2g,精密加入200ng·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液1mL,同法測(cè)定,各標(biāo)準(zhǔn)品回收率見(jiàn)表2。2.3結(jié)果表明，烏豐丸中含有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量2.3.1fpd設(shè)備進(jìn)樣RESTEKRtx-5彈性石英毛細(xì)管柱(0.25μm×0.25mm×30m),柱升溫程序:初始溫度60℃,以30℃·min-1升至120℃,再以5℃·min-1升至130℃,保持3min,以15℃·min-1升至180℃,保持5min,以15℃·min-1升至270℃,保持4min,進(jìn)樣口溫度250℃,不分流進(jìn)樣,FPD檢測(cè)器溫度120℃,載氣高純氮,柱流速1.50mL·min-1,氫氣流速90mL·min-1,空氣流速115mL·min-1,進(jìn)樣量1.0μL。有機(jī)磷混合對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖2。2.3.2標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定取同仁烏雞白鳳丸,研細(xì),精密稱取3g,照《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄ⅨQ“農(nóng)藥殘留量測(cè)定法”測(cè)定了12種有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留量,結(jié)果10批樣品中均未檢出有機(jī)磷類農(nóng)藥,標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程見(jiàn)表4。為保證含量測(cè)定的可靠性,隨行制備了加樣回收樣品,取供試品3g,精密加入濃度為1μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5mL,同法測(cè)定。2.4同一恒優(yōu)白鳳丸中，擬消除菊酯類農(nóng)藥殘留2.4.1氯氰菊酯檢測(cè)色譜條件:DB-5彈性石英毛細(xì)管柱(0.25μm×0.25mm×30m),柱升溫程序:初始溫度60℃,以30℃·min-1升至120℃,再以10℃·min-1升至200℃,以2℃·min-1升至230℃,以30℃·min-1升至280℃,保持7min,進(jìn)樣口溫度250℃,不分流進(jìn)樣,載氣高純氦,柱流速1.40mL·min-1,進(jìn)樣量1.0μL。質(zhì)譜條件:負(fù)化學(xué)電離離子源(NCI),電壓1.0kV,溫度200℃,選擇離子(SIM)模式監(jiān)測(cè):29.00～30.00min,選擇碎片離子207(定量離子),171(定性離子),對(duì)氯氰菊酯進(jìn)行檢測(cè);30.00～31.50min,選擇碎片離子211(定量離子),167(定性離子),對(duì)氰戊菊酯進(jìn)行檢測(cè);31.50～33.20min,選擇碎片離子79(定量離子),137(定性離子),對(duì)溴氰菊酯進(jìn)行檢測(cè),混合標(biāo)準(zhǔn)品的選擇離子掃描質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3。2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密稱取氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯對(duì)照品適量,加醋酸乙酯配制成1μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液,精密移取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,加醋酸乙酯逐步稀釋成1,10,50,100,200ng·mL-1的混合對(duì)照品溶液,按上述色譜條件進(jìn)樣,每個(gè)濃度進(jìn)樣3次,以質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo),平均峰面積值Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,各標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程見(jiàn)表5。2.4.3樣品測(cè)定和樣品測(cè)定取同仁烏雞白鳳丸,研細(xì),精密稱取2g,照《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄ⅨQ“農(nóng)藥殘留量測(cè)定法”下“擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥殘留測(cè)定”項(xiàng)下方法制得供試品,按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,部分樣品中檢出氯氰菊酯,其余擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥均未檢出,結(jié)果批號(hào)4030271,5035022,5035023的3批樣品中氯氰菊酯殘留量0.005,0.008,0.004mg·kg-1。為考察含量測(cè)定的準(zhǔn)確性,隨行制備了加樣回收樣品,各標(biāo)準(zhǔn)品回收率見(jiàn)表5。3樣品的制備和加樣回收率的測(cè)定中國(guó)、FAO/WHO、歐盟對(duì)藥材(或草藥)中本實(shí)驗(yàn)涉及的重金屬及農(nóng)藥殘留限量的規(guī)定與10批樣品測(cè)定結(jié)果的最大值的比較見(jiàn)表6,由表可知,所測(cè)樣品中重金屬含量均未超過(guò)《中國(guó)藥典》的限量要求,而農(nóng)藥殘留量均未超過(guò)《中國(guó)藥典》和歐洲藥典的限量要求,因《中國(guó)藥典》僅對(duì)少數(shù)農(nóng)藥規(guī)定了限量,建議以《中國(guó)藥典》和歐洲藥典的限量為參考分別對(duì)同仁烏雞白鳳丸中重金屬和農(nóng)藥殘留量進(jìn)行控制。經(jīng)比較實(shí)驗(yàn),三步消解比一步消解效果好,故采用三步操作制備重金屬測(cè)定用供試品。另經(jīng)考察發(fā)現(xiàn),在120℃酸性環(huán)境中加熱濃縮,砷、汞無(wú)損失。汞的原子熒光測(cè)定中加入5%高錳酸鉀將樣品中各種形式的汞氧化成同價(jià)態(tài)的汞,再與活潑態(tài)氫生成氫化汞,汞化氫進(jìn)一步被氫離子還原成原子態(tài)汞進(jìn)入吸收池測(cè)定。5%鹽酸羥胺的作用是還原過(guò)剩的高錳酸鉀。原子熒光法測(cè)砷時(shí)加入25%碘化鉀將溶液中的各種高價(jià)態(tài)的砷還原為同價(jià)態(tài)的砷,然后與活潑態(tài)氫生成氫化砷,進(jìn)一步生成原子態(tài)砷用于測(cè)定。碘化鉀被氧化后生成的碘用10%抗壞血酸還原,同時(shí),抗壞血酸對(duì)干擾金屬離子也起到一定的掩蔽作用。因農(nóng)藥殘留測(cè)定屬痕量檢測(cè),環(huán)境、試劑和樣品中的其他成分均易造成干擾,所以應(yīng)隨行加樣回收實(shí)驗(yàn),以確保結(jié)果的可靠性。對(duì)于農(nóng)藥殘留測(cè)定,隨行回收率可接受的范圍是60%～140%,本實(shí)驗(yàn)中用于測(cè)定擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥隨行回收率的溶液進(jìn)樣前放置過(guò)久,可能導(dǎo)致被測(cè)成分分解,造成實(shí)驗(yàn)回收率低。因農(nóng)藥殘留的測(cè)定為痕量檢測(cè),為排除假陽(yáng)性結(jié)果,采用另一極性的色譜柱對(duì)有機(jī)氯殘留測(cè)定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。色譜條件為:DB-5彈性石英毛細(xì)管柱(0.25μm×0.25mm×30m),柱升溫程序:初始溫度120℃,以30℃·min-1升至180℃,再以5℃·min-1升至210℃,保持10min,以15℃·min-