一株去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織形態(tài)參數(shù)的變化

一株去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織形態(tài)參數(shù)的變化

隨著老齡化社會的到來，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的預防和治療已成為人們關(guān)注的問題之一。中醫(yī)藥在此領(lǐng)域有著明顯的優(yōu)勢,開發(fā)治療骨質(zhì)疏松的中成藥具有重要意義。我們在以往的工作中發(fā)現(xiàn)烏雞白鳳丸對實驗性骨質(zhì)疏松大鼠有一定的防治作用,為進一步探討其對骨微觀結(jié)構(gòu)的影響,本研究采用卵巢切除致大鼠骨質(zhì)疏松模型,通過骨形態(tài)計量學參數(shù)的變化,以評價其抗骨質(zhì)疏松作用。1材料和方法1.1材料表面1.1.1g/粒—藥物與試劑烏雞白鳳丸(54g/瓶),藥都制藥集團股份有限公司,批號060501;仙靈骨葆膠囊(0.5g/粒),貴州同濟堂制藥有限公司,批號060412;鹽酸四環(huán)素,江蘇長青獸藥有限公司,批號20060712;甲基丙烯酸甲酯,北京益利精細化學品有限公司,批號960523;鄰苯二甲酸二丁酯,北京化學試劑公司,批號970628;過氧化苯甲酰,北京金龍化學試劑有限公司,批號20000420。1.1.2leicaqun管理Reicheit-Jung2040切片機(德國);LeicaQwin圖象分析系統(tǒng)(德國);Olympus顯微鏡(日本);Opton熒光顯微鏡(德國)。1.1.3動物飼料中心6月齡SD大鼠(清潔級),♀性,由河北省實驗動物中心提供,許可證號為:SCXK(冀)2003-1-3,動物飼料亦由該中心提供;各組大鼠分籠飼養(yǎng),自由攝食、飲水,光照12h,黑暗12h,室溫20～24℃,相對濕度40%～70%。1.2動物分組、藥物行為和統(tǒng)計學處理1.2.1動物模型將大鼠以10%水合氯醛按350mg/kg腹腔注射麻醉,腹位固定,無菌條件下摘除雙側(cè)卵巢,逐層縫合肌肉和皮膚切口,假手術(shù)組只做同樣操作但不切除卵巢。1.2.2分組與給藥術(shù)后1周,將存活的大鼠按體重隨機分為假手術(shù)組、去卵巢模型組、烏雞白鳳丸低劑量組(1.0g/(kg·d))、烏雞白鳳丸中劑量組(2.0g/(kg·d))、烏雞白鳳丸高劑量組(4.0g生藥/(kg·d))及陽性藥仙靈骨葆組(0.6g/(kg·d)),每組10只。各組大鼠每天上午灌胃給藥,給藥容量為10mL/kg,假手術(shù)組及去卵巢模型組大鼠給予等容量蒸餾水,連續(xù)灌胃12周。1.2.3標本處理各組動物于處死前16d和前3d分別腹腔注射鹽酸四環(huán)素30mg/kg體重以對骨進行熒光標記。末次給藥后,將各組大鼠迅速斷頭處死,剝離出脛骨,用70%乙醇固定。取大鼠左側(cè)脛骨近端1/3,去除軟組織。用乙醇逐級脫水,二甲苯透明,每級各兩次,每次24h。浸透液的配制:Ⅰ液:甲基丙烯酸甲酯75mL,鄰苯二甲酸二丁酯25mL;Ⅱ液:在Ⅰ液的基礎(chǔ)上加過氧化苯甲酰1g;Ⅲ液:在Ⅰ液的基礎(chǔ)上加過氧化苯甲酰2.5g。以上三液,用磁力攪拌器充分攪勻。標本在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ液各浸透36h。在青霉素小瓶中注入約5mL的Ⅲ液,將標本按同一方向放入瓶中,然后置于40℃烘箱中聚合3～4d,待變?yōu)闊o色透明的堅硬包埋塊后,砸碎小瓶,取出包埋塊。修塊后,在切片機上,用鎢鋼刀分別切出5μm的縱向不脫鈣骨切片。一片用二甲苯溶掉樹脂后,梯度乙醇至水,甲苯胺藍染色,觀察靜態(tài)指標;另一片直接在熒光顯微鏡下做動態(tài)指標測定,觀察。1.2.4觀測指標按謝雁鳴等人的方法,采用LeicaQwin圖象分析系統(tǒng)進行骨組織形態(tài)計量。1.2.4.1骨小梁組織形態(tài)計量:①骨小梁體積百分比(TBV%):骨小梁體積/被測骨髓腔總體積×100%,是骨量水平的主要標志;②骨小梁吸收表面百分比(TRS%):不規(guī)則、凹凸不平的骨小梁表面/骨小梁表面×100%;③骨小梁形成表面百分比(TFS%):有成骨細胞被覆的類骨質(zhì)表面/骨小梁表面×100%;④活性生成表面百分比(AFS%):有熒光標記帶的骨小梁表面/骨小梁表面×100%;⑤骨小梁礦化率(MAR):骨小梁表面熒光雙標記帶的平均距離/兩次標記相隔的天數(shù);⑥骨小梁骨生成率(BFR):AFS%×MAR。1.2.4.2皮質(zhì)內(nèi)表面形態(tài)計量:①類骨質(zhì)平均寬度(OSW):皮質(zhì)內(nèi)表面類骨質(zhì)的平均寬度;②骨皮質(zhì)礦化率(mAR):皮質(zhì)內(nèi)表面雙標記帶的平均距離/兩次標記相隔的天數(shù)。1.2.5統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,用SPSS12.0軟件進行分析。各組間比較采用單因素方差分析,樣本均數(shù)間的兩兩比較采用LSD-t檢驗。2結(jié)果2.1trs%和trs%對大鼠trs%的影響結(jié)果可見,去卵巢模型組大鼠TBV%較假手術(shù)組大鼠明顯降低(P<0.01),TRS%較假手術(shù)組大鼠明顯升高(P<0.01);烏雞白鳳丸組大鼠TBV%明顯較去卵巢模型組大鼠升高(P<0.01),TRS%明顯較去卵巢模型組大鼠降低(P<0.05或P<0.01),見表1。2.2假手術(shù)組和假手術(shù)組大鼠r比較結(jié)果可見,去卵巢模型組大鼠TFS、AFS、MAR和BFR均較假手術(shù)組大鼠明顯升高(P<0.01);烏雞白鳳丸組大鼠TFS%、AFS%、MAR、BFR均明顯較去卵巢模型組大鼠降低(P<0.05或P<0.01),見表2。2.3高p>0.1結(jié)果可見,去卵巢模型組大鼠OSW、mAR較假手術(shù)組大鼠、明顯升高(P<0.01);烏雞白鳳丸組(1.0g/kg、2.0g/kg、4.0g/kg)組大鼠脛骨OSW、mAR明顯較去卵巢模型組大鼠降低(P<0.05或P<0.01),見表3。3雞白鳳丸的病理改變骨組織顯微結(jié)構(gòu)的改變是導致骨質(zhì)疏松癥及并發(fā)骨折的重要病理環(huán)節(jié),骨組織形態(tài)計量學指標是直接反映骨形成與骨吸收的重要指標,也是評估骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)和骨質(zhì)疏松程、診斷分型及確定療效的重要指標。祖國醫(yī)學認為:“腎藏精,主骨生髓?！眿D女絕經(jīng)后,腎氣漸衰,腎精虛少,骨髓化源不足,不能營養(yǎng)骨骼,進而導致骨骼脆弱無力,出現(xiàn)腰脊酸軟疼痛,下肢乏力,遇外力易發(fā)生骨折等骨質(zhì)疏松癥狀。中西醫(yī)結(jié)合對腎本質(zhì)的研究表明:腎虛時有下丘腦—垂體—性腺軸功能減退,雌激素分泌減少。可見,中醫(yī)的腎虛是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的主要病理生理學基礎(chǔ)。眾多醫(yī)家對骨質(zhì)疏松癥進行辨證時發(fā)現(xiàn),腎虛是其主要病機,但往往多伴有脾虛、血瘀之征。脾主運化,脾胃虛弱,水谷攝入不足,氣血生化之源潰乏,后天之精不能滋養(yǎng)腎水、腎精,致使筋骨失養(yǎng),所以在補腎的同時也應顧及對脾胃的培養(yǎng)。腎中精血不足,不能充骨生髓,筋骨失養(yǎng),復感寒濕,凝滯筋骨,使氣血痹阻,不通則痛,故在補腎的同時也應適當理氣活血。烏雞白鳳丸源于《普濟方》,是婦科常用調(diào)經(jīng)之方。方中甘溫的熟地黃與咸寒的鱉甲以滋補腎陰;烏雞、鹿角膠、鹿角霜以溫壯腎陽,四藥合用以溫補下元為君。桑螵蛸、牡蠣、芡實助陽益火,桑螵蛸經(jīng)冬之陰,又迎來年春天少陽升發(fā)之氣,可引火歸元,使浮陽返歸于腎;白芍、天冬滋陰壯水,斂陰以涵陽,共為臣藥,穩(wěn)固下元。佐以人參、黃芪大補脾肺氣,以資氣血生化之源,配伍當歸養(yǎng)血和營,使所補的無形之氣依附有形之血,解除血虛陽浮,陰不維陽之虞;川芎與歸、芍、熟地組成四物湯,再配伍丹參養(yǎng)血活血,香附疏肝理氣,使氣行血活;山藥健脾化濕,祛生痰之源;銀柴胡斂陰退虛熱,透其不盡之邪,使風無留著,至此,引動內(nèi)風的誘因隨之云散。甘草固守中州,調(diào)和諸藥為使藥。諸藥合用,使下元穩(wěn)固,虛陽得潛。本實驗采用6月齡SD大鼠摘除卵巢復制絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型,研究結(jié)果顯示,大鼠切除卵巢