酶法和酸法提取雞花青素的比較

酶法和酸法提取雞花青素的比較

結(jié)果表明，烏烏的黑色素具有去自由基和抗癌作用。目前對于烏雞黑色素的提取方法報道多為酸法,酶法研究的較少。在酶法與酸法提取的烏雞黑色素的功能性質(zhì)比較方面,尚未見報道。實驗以江西泰和烏雞為研究對象,研究了2種方法提取的烏雞黑色素的性能差異。1材料和方法1.1試劑及標準品烏雞:江西省泰和縣生物谷食品科技工業(yè)園;木瓜蛋白酶(≥6000U/mg):國藥集團化學(xué)試劑有限公司;風(fēng)味酶(20000U/mg):南寧龐博生物工程有限公司;黃油:金力國際貿(mào)易公司;唾液鏈球菌嗜熱亞種(1.1855)(Bulgaricusstreptococcussalivariussubsp,簡稱St),購于中國科學(xué)院微生物研究所。1.2硫代硫酸鈉乙醇酯類DPPH·(購于Sigma公司);石油醚;酚酞;無水乙醇;無水乙醚;KOH;KI;三氯甲烷;冰乙酸;硫代硫酸鈉;可溶性淀粉等,均為分析純。1.3實驗方法1.3.1石油醚沉淀物沉淀物汁酸法:全凈膛烏雞→剔骨取肉→絞碎→濃HCl浸泡(12mol/LHCl,肉酸比1∶2,40℃,12h)→過濾→離心(10000r/min,5min)→收集沉淀物→蒸餾水洗至中性→丙酮洗→石油醚(30～60℃沸程)、蒸餾水洗滌至pH中性→沉淀物冷凍干燥→黑色素。酶法:全凈膛烏雞→剔骨取肉→絞碎→加熱(肉水比1∶1,100℃,15min)→木瓜蛋白酶酶解(3.8%,pH5.5,65℃,2h)→風(fēng)味酶酶解(0.6%,pH6.0,55℃,6h)→滅酶→過濾→離心(10000r/min,5min)→收集沉淀物→乙醚、蒸餾水反復(fù)洗滌至pH中性→沉淀物冷凍干燥凍干→黑色素。1.3.2譜儀測定取干燥黑色素粉末10mg,直接用JES-FA200型電子自旋共振波譜儀(日本電子公司)測定。測定條件:微波功率0.998mW,微波頻率9.06GHz,中心磁場323.3mT,掃描寬度±2.5mT,掃描時間1.0min,調(diào)制頻率100kHz,調(diào)制幅度0.3mT。1.3.3掃描電子顯微鏡掃描將2種烏雞黑色素粉末分別粘在碳膠帶上,噴金處理,用Sirion200場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FEI公司)掃描照射并拍片,加速電壓5.0kV。分辨率:3.5nm(500V);2.5nm(1kV);1.5nm(>10kV)。1.3.4不同濃度的酸性對菌液活菌率的影響以脫脂乳為培養(yǎng)基活化菌種,取充分活化的菌液于已滅菌的三角瓶中,添加無菌生理鹽水V(菌液)∶V(無菌生理鹽水)=1∶9,震蕩30min,打碎菌塊,制得菌懸液,備用。取10mL菌懸液與1mL(2mg/mL)的黑色素水懸液于平皿(Φ90mm)中充分混合,分為酸法和酶法黑色素2組,以10mLSt菌懸液+1mL無菌水為對照組,置于20W紫外燈下方30cm處照射,其間經(jīng)常振搖平皿。在照射0、2、4、6、8、10min后,各取出1mL以10倍稀釋法稀釋,取不同稀釋度的菌液0.1mL進行平板涂布,然后置于42.5℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24h后菌落計數(shù)。同法,每組于照射前進行平板培養(yǎng)計數(shù),比較照射前后菌落數(shù)差別,用活菌率表示。實驗至少重復(fù)3次。活菌率/%=照射后的平均菌落數(shù)照射0min時的平均菌落數(shù)×100/%=照射后的平均菌落數(shù)照射0min時的平均菌落數(shù)×1001.3.5嘴唇下門事件DPPH·法。將酶法與酸法提取的烏雞黑色素分別配成黑色素-Na2CO3溶液,黑色素濃度:0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mg/mL。按文獻方法進行抗自由基能力實驗。1.3.6抗疲勞性能的比較將酶法與酸法黑色素分別加入融化的黃油中,置于70℃烘箱中進行加速氧化試驗,按GB/T5009.37-2003方法測定其過氧化值變化。1.3.7光和純度1.3.7.含量測定將酶法與酸法提取的烏雞黑色素分別配制成濃度為0.2mg/mL的黑色素-Na2CO3溶液,置于光照培養(yǎng)箱中光照,光照度強為2700Lx,每12h于560nm下測定1次吸光值。1.3.7.2.加熱處理將0.2mg/mL的2種黑色素-Na2CO3溶液分別經(jīng)25、50、75、100℃加熱處理4h,于560nm下測定吸光值。1.4處理數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)以平均值表示。采用SAS9.0進行方差顯著性分析,用Duncan新復(fù)極差法進行多重比較。2結(jié)果與分析2.1典型線條一次微商波譜經(jīng)EPR波譜儀測定,酶法與酸法提取的黑色素的波形均為稍不對稱的典型單線一次微商波譜,如圖1所示。無超精細結(jié)構(gòu),G值為2.003,線寬△Hpp5.3～5.7,與文獻報道的基本一致,表明了黑色素的信號特征,證明酶法與酸法提取物均為黑色素。2.2多次酶法分離實物中的激素從圖2和圖3的電鏡圖片可以看出,烏雞中的黑色素顆粒呈橢圓形或圓形。酶法提取的烏雞黑色素顆粒表面清晰光滑,酸法提取的烏雞黑色素顆粒表面粗糙。在顆粒尺寸上(平均約為),酸法:長691.9nm,寬389.2nm;酶法:長662.9nm,寬389.7nm。由此可見,酶法黑色素顆粒略小于酸法,酸提取法對黑色素顆粒表面造成了一定的損傷。閻克路等在研究用蛋白酶和鹽酸分離牦牛絨中的黑色素時也發(fā)現(xiàn)了類似的情況,分析認為,可能是酸與黑色素主要結(jié)構(gòu)——吲哚環(huán)上的NH-基發(fā)生反應(yīng),使黑色素結(jié)構(gòu)變得相對松弛,顆粒尺寸較大。此外,酸的水解催化作用,導(dǎo)致黑色素發(fā)生了一定程度的水解,使黑色素顆粒表面變粗糙;而蛋白酶分子質(zhì)量大,很難滲入黑色素顆粒內(nèi)部,而且由于酶的專一性,不會作用于黑色素,因此在分離過程中對黑色素造成損傷的可能性小。因而,酶法提取的黑色素顆粒較酸法的光滑且尺寸略小。2.3酶法和酸法對活菌率的影響由表1可以看出,經(jīng)2min紫外燈照射后,酶法的活菌率明顯高于酸法,分別為85.9%和69.8%。隨著照射時間的延長,各組活菌率均有明顯的下降。但酶法與酸法活菌率之間在照射2～6min時,酶法極顯著高于酸法(P<0.01),但8min以后,酶法與酸法幾乎沒有區(qū)別。2組活菌率均極顯著高于對照﹙(P<0.01)。說明烏雞黑色素有較強的抗紫外線功能,在抗紫外線效果上酶法要優(yōu)于酸法。2.4酶法抑制率測定由表2得知,酸法與酶法提取的烏雞黑色素均有較強的清除DPPH·的能力。當(dāng)黑色素濃度在0.05～0.2mg/mL,酶法抑制率明顯高于酸法;濃度在0.1mg/mL時,2者差異顯著(P<0.05),濃度高于0.3mg/mL后,2者相當(dāng)。這種現(xiàn)象是否意味著在較高濃度時,濃度成了主要影響因素,消除了酸損傷的不利影響則有待進一步研究。2.5不同方法對過氧化過程的抑制效果由表3知,各濃度組中,酶法黑色素組過氧化值均略低于酸法黑色素組,但差異不顯著。加黑色素的各組過氧化值均低于對照,且隨著添加量增加,對過氧化過程的抑制效果也隨之提高,可見,酶法與酸法黑色素均有較強的抗氧化功能,時間越長,體現(xiàn)越明顯;酶法黑色素的抗氧化性略高于酸法。2.6不同酸法與酶法色譜法提取的雞氧化酶穩(wěn)定性的比較見表1由圖4可知,經(jīng)光照處理后,酸法黑色素液吸光值下降速率低于酶法黑色素的下降速率。光照48h后酸法黑色素吸光值從最初的0.908降到0.751,降低了0.157;而同期酶法黑色素液吸光值則減少了0.432。這說明酸法提取的烏雞黑色素光穩(wěn)定性優(yōu)于酶法黑色素。但熱穩(wěn)定性方面,酸法不及酶法。由圖5可見,隨著溫度的升高,2組吸光值均下降,但酸法烏雞黑色素吸光值的下降速率約是酶法的3倍。3在dpph自由基因素上提取抗氧化性(1)酶法烏雞黑色素顆粒表面清晰光滑,而酸法黑色素顆粒表面較粗糙、有損傷。顆粒尺寸上,酸法黑色素顆粒略大于酶法顆粒。(2)烏雞黑色素有很強的抗紫外線功能。在抗紫外線效果上酶法優(yōu)于酸法。輻照2min后,未加黑色素的活菌率只有1.3%,加酸的活菌率是69.8%,而加酶的活菌率達85.7%。但酶法活菌率在照射8min前均大大高于酸法,8min以