豬A型塞內(nèi)卡病毒分離鑒定

豬A型塞內(nèi)卡病毒分離鑒定范圍本文件規(guī)定了豬A型塞內(nèi)卡病毒分離鑒定方法、RT-LAMP及RT-PCR診斷方法。本文件適用于豬A型塞內(nèi)卡病毒的病原分離和鑒定、實(shí)驗(yàn)室診斷、病毒檢測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法NY/T541-2016獸醫(yī)診斷樣本采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范縮略語下列縮略語適用于本文件。SVA：豬A型塞內(nèi)卡病毒（曾用名：SVV）PBS：磷酸緩沖液DMEM：細(xì)胞營養(yǎng)液FBS：胎牛血清PK-15：豬腎細(xì)胞CPE：細(xì)胞病變DNAmarker：DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記HEPES：4-羥乙基哌嗪乙磺酸RT-LAMP：逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑與設(shè)備試劑與耗材所用生化試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682一級(jí)水要求或采用超純水，并經(jīng)高溫滅菌；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記（100bp~2000bp）、2×PCR混合液、1%的X脂糖凝膠、MgSO4、無水乙醇、BstDNA聚合酶、核酸染料、dNTPs、LAMPbuffer等；無菌移液器吸頭、無菌眼科剪、一次性注射器、眼科鑷、無菌離心管；PK-15細(xì)胞、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、HEPES緩沖液（1mol/L儲(chǔ)存液）、25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶、0.22μm的一次性濾頭、0.01mol/LpH7.0~7.4PBS（參見附錄A）；4.1.6陽性對(duì)照：SVA（SVV-SC-01株）；陰性對(duì)照：PK-15細(xì)胞培養(yǎng)上清液；主要儀器設(shè)備微量移液器、組織破碎儀、組織研磨器、恒溫水浴槽或恒溫金屬浴、離心機(jī)、二氧化碳恒溫箱、通用型電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、熒光倒置顯微鏡、冰箱（2℃~8℃、-20℃、-70℃）。樣品的采集、保存與運(yùn)輸樣品采集水泡液采集用一次性注射器吸取臨床發(fā)病豬只水泡液0.5~1ml，并將水泡液裝入保存管，加青霉素1000IU/mL、鏈霉素500IU/mL，加蓋封口，-70℃冷凍保存。水泡皮采集用0.01mol/LPBS（pH7.4）清洗水泡表面，然后用滅菌手術(shù)剪刀剪取水泡皮，2~5g為宜。采集到的水泡皮，裝入樣品保存管，加50%甘油-PBS保存液，使保存液液面沒過樣品，加蓋封口，-70℃冷凍保存。組織樣品采集若采集不到典型的水泡皮，則采集病灶周圍破潰組織或淋巴結(jié)、肺臟、扁桃體、腸道等組織5~10g，裝入樣品保存管，加50%甘油-PBS保存液，使保存液液面沒過樣品，加蓋封口，-70℃冷凍保存。保存與運(yùn)輸采集的樣品應(yīng)按照《獸醫(yī)診斷樣本采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范》（NY/T541-2016）要求包裝和運(yùn)輸。病毒的細(xì)胞分離培養(yǎng)樣品的處理組織樣品處理取0.5g待檢組織樣品，加入1ml的PBS緩沖液置組織均漿器中充分研磨（或采用傳統(tǒng)液氮法研磨樣本），反復(fù)凍融3次后，用含青、鏈霉素的DMEM作3∶1（V/W）稀釋，3000r/min離心10min，取上清液，-70℃保存?zhèn)溆??；驅(qū)⒊浞盅心ァ⒎磸?fù)凍融3次后的樣本加PBS緩沖液作3：1（V/W）稀釋后以0.22μm無菌濾膜過濾除菌后，-70℃保存?zhèn)溆?。水泡液樣品處理水泡?℃3000r/min離心10min，以0.22μm無菌濾膜過濾除菌后，-70℃保存?zhèn)溆?。單層?xì)胞制備在生物安全柜中操作，按常規(guī)方法將PK-15細(xì)胞或其他敏感細(xì)胞分裝在25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶加入含8%FBS的DMEM培養(yǎng)基5mL，細(xì)胞濃度應(yīng)為2~3×105個(gè)/mL，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48h。樣品接種在生物安全柜中操作，取6.1中已處理好的上清液0.2ml接種到生長(zhǎng)狀況良好的單層PK-15細(xì)胞上（5ml工作體積）。每份樣品接種2~4瓶細(xì)胞，另設(shè)細(xì)胞對(duì)照2~4瓶。37°C吸附1h，棄上清，加入5ml含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48h。病毒收獲每天觀察記錄CPE，若被檢樣品中有A型塞內(nèi)卡病毒，通常在接種48h后可出現(xiàn)CPE，主要呈現(xiàn)細(xì)胞變圓，空泡增加，有死細(xì)胞漂浮在液面，最后溶解脫落。對(duì)照細(xì)胞單層應(yīng)完好，細(xì)胞形態(tài)基本正?；蛏杂兴ダ?。若出現(xiàn)CPE，將接毒細(xì)胞反復(fù)凍融三次，4℃3000r/min離心10min，收獲病毒上清液，置-70℃保存，進(jìn)行病毒核酸鑒定。若接種細(xì)胞第1代72h后未出現(xiàn)明顯CPE，按上述收毒方法收獲細(xì)胞/病毒液再接種生長(zhǎng)良好的單層細(xì)胞進(jìn)行盲傳，即1mL第一代細(xì)胞/病毒液加4mL細(xì)胞維持液，37℃培養(yǎng)。如此盲傳3~5代，再進(jìn)行鑒定。病毒核酸鑒定對(duì)6.4中收集到細(xì)胞/病毒液，或經(jīng)6.1處理后的臨床樣品，選用RT-LAMP方法（逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法）和RT-PCR方法進(jìn)行核酸鑒定。RT-PCR和RT-LAMP引物根據(jù)GenBank上已發(fā)表的SVA核酸序列（登錄號(hào)：KY618836），選擇編碼VP1蛋白的序列作為RT-LAMP和RT-PCR的靶序列，運(yùn)用PrimerExplorerV4軟件設(shè)計(jì)一組RT-LAMP引物，包括外引物F3、B3，內(nèi)引物FIP、BIP，使用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物（F/R）進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，相關(guān)引物序列見表1。表1引物序列檢測(cè)方法引物序列5′→3′位置bpRT-LAMPSVVF3CCGATCTCGACTACTGAATG2866～2886SVVB3GAGAACGCCACTGTCAGAC3017～3036SVVFIPCATCGTCCTGCTGTGCACCT-AGAAGGACGCCGTCTTCC2881～2941SVVBIPTTCTAACACCCCGCCCAACA-TTGACGTACAGGCCGAAAC2953～3013RT-PCRSVVFTACAGTTTGGCCTGTTTCACT3063～3083SVVRCGCCCAGTAAAGTGGTAGGG3210～3229RNA的提取選擇市售商品化RNA提取試劑盒，按照試劑盒操作說明書提取樣品中的RNA。在提取RNA時(shí)，應(yīng)設(shè)立陽性和陰性對(duì)照樣品，按同樣的方法提取RNA。RNA提取操作應(yīng)在通風(fēng)柜或生物安全柜中進(jìn)行，避免RNA氣溶膠的污染。反轉(zhuǎn)錄（cDNA的合成）配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，使用商品化反轉(zhuǎn)錄試劑盒將7.2中提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體操作、體系參照說明書進(jìn)行，cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩T-LAMP反應(yīng)RT-LAMP反應(yīng)體系反應(yīng)體系中各組分見表2。表2RT-LAMP反應(yīng)體系反應(yīng)試劑總體系25μLBstDNA聚合酶緩沖液2.5μLRNA酶抑制劑（40U/μl）0.5μL反轉(zhuǎn)錄酶（200U/μl）0.75μLBstDNA聚合酶1μL甜菜堿（1mmol/l）2μLMgSO4（8mmol/l）2μL引物F3/B3（0.2μmol/l）各2μL引物FIP/BIP（1.6μmol/l）各4μLdNTPs（1.4mmol/L）2μLRNA模板（7.2中提?。?μLddH2O1.25μL其中BstDNA聚合酶緩沖液各組分為20mMTris-HCl（pH8.8），10mMKCl，10mM（NH4）2SO4，0.1%TritonX-100。RT-LAMP反應(yīng)程序?qū)?.4.1配制的反應(yīng)體系置于65℃水浴或金屬浴反應(yīng)45min后，再置于80℃反應(yīng)10min，產(chǎn)物4℃保存。RT-PCR反應(yīng)RT-PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系見表3。表3RT-PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)試劑總體積10μLμL2×TaqPCRmasterMix5上游引物：F（10μmol/L）0.5下游引物：R（10μmol/L）0.5cDNA模板（7.3中產(chǎn)物）1ddH2O（無菌水）3RT-PCR反應(yīng)程序反應(yīng)程序見表4。表4RT-PCR反應(yīng)程序步驟時(shí)間和溫度min、s/℃循環(huán)數(shù)個(gè)預(yù)變性5min/95℃1變性30s/95℃35退火30s/56℃延伸30s/72℃延伸7min/72℃1試驗(yàn)結(jié)果觀察RT-LAMP顯色反應(yīng)在每個(gè)RT-LAMP反應(yīng)管內(nèi)加入熒光染料SYBRGreenI0.5μL，渦旋混勻，在紫外光下觀察。X脂糖凝膠電泳成像PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取適量擴(kuò)增產(chǎn)物加到1%的X脂糖凝膠加樣孔中，并加入陽性、陰性對(duì)照和DNAmarker。使用電泳儀進(jìn)行電泳，電壓大小根據(jù)電泳槽長(zhǎng)度確定，一般控制在4V/cm~6V/cm，電泳時(shí)間為10~20min。電泳結(jié)束后，將凝膠放在凝膠成像儀中觀察記錄成像結(jié)果。結(jié)果判定將RT-LAMP方法作為臨床快速檢測(cè)手段，最終分離鑒XX果需結(jié)合病毒分離和RT-PCR擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果進(jìn)行綜合判定。RT-LAMP成立條件對(duì)照成立，即電泳結(jié)果陰性對(duì)照無條帶，陽性對(duì)照為1條梯狀條帶，且顯色反應(yīng)陰性對(duì)照管無變化，陽性對(duì)照管發(fā)出綠色熒光。陰性判定電泳結(jié)果未出現(xiàn)與陽性對(duì)照一致條帶，顯色反應(yīng)樣品管無綠色熒光變化，判定為：SVA核酸陰性。陽性判定電泳結(jié)果出現(xiàn)與陽性對(duì)照一致條帶，且顯色反應(yīng)樣品管發(fā)出綠色熒光，判定為：SVA核酸陽性。RT-PCR成立條件對(duì)照成立，即電泳結(jié)果陰性對(duì)照無條帶，陽性對(duì)照出現(xiàn)1條167bp的DNA目的條帶。陰性判定電泳結(jié)果未出現(xiàn)與陽性對(duì)照大小一致DNA條帶，判定為：SVA核酸陰性。陽性判定電泳結(jié)果出現(xiàn)與陽性對(duì)照大小一致的DNA條帶，判定為：SVA核酸陽性。對(duì)陽性擴(kuò)增條帶進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與附錄B.3序列比對(duì)，作為分離鑒定最終判定條件。病毒分離鑒定若細(xì)胞發(fā)生CPE，同時(shí)8.1或8.2結(jié)果為陽性，且測(cè)序比對(duì)結(jié)果正確，則判定為：SVA分離鑒定陽性若盲傳3代后，細(xì)胞并未發(fā)生CPE，但8.1或8.2結(jié)果為陽性，則繼續(xù)盲傳至5代后，再進(jìn)行RT-LAMP或RT-PCR核酸鑒定，若8.1或8.2結(jié)果仍為陽性，且測(cè)序比對(duì)結(jié)果正確，則判定為：SVA分離鑒定陽性，若8.1或8.2結(jié)果變?yōu)殛幮裕瑒t判定為：SVA分離鑒定陰性。若盲傳3代后，細(xì)胞并未發(fā)生CPE，且8.1或8.2結(jié)果為陰性，則判定為：SVA分離鑒定陰性。

（規(guī)范性附錄）

試劑配制0.01mol/LpH7.0~7.4PBSNaCl8gKCl0.2gNa2HPO4?12H2O3.58gKH2PO40.27g滅菌雙蒸水800mLNaOH或者HCl調(diào)pH值7.0~7.4，滅菌雙蒸水定容至1000mL，121℃、15min高壓鍋滅菌冷卻，置常溫或4℃?zhèn)溆?。電泳緩沖液TAE（50倍）三羥甲基甲烷堿（Trisbase）242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L（pH8.0）乙二胺四乙酸（EDTA）100mL蒸餾水100mL待上述混合物完全溶解后，加蒸餾水至1000mL，置4℃冰箱中備用，如配制1%的X脂糖凝膠和用作電泳緩沖液，則用蒸餾水稀釋50倍，成TAE電泳緩沖液。1.0%X脂糖凝膠板制備X脂糖1.0g1×TAE緩沖液100mL0.5ug/mLGoldView5uL微波爐充分溶解后，加入溴化乙錠，倒入凝膠板中，在距離底板0.5mm的位置上放置梳子，凝膠的厚度為4mm，待凝膠完全凝固后，小心移去梳子，將凝膠板放入電泳槽中，電泳緩沖液沒過膠面。

（資料性附錄）

豬A型塞內(nèi)卡病毒簡(jiǎn)介豬A型塞內(nèi)卡病毒簡(jiǎn)介A型塞內(nèi)卡病毒（SenecavirusA，SVA）又稱為塞尼卡谷病毒（Senecavalleyvirus，SVV），是一類無囊膜單股正鏈RNA病毒，屬于小核糖核酸病毒科，塞內(nèi)卡病毒屬，是該屬唯一成員。SVA基因組全長(zhǎng)約7300nt，由一個(gè)6543nt的開放閱讀框，668nt的5’端非編碼區(qū)，68nt的3’端非編碼區(qū)以poly（A）尾組成。SVA病毒粒子為二十面體結(jié)構(gòu)，呈小型近圓形，直徑約為17～25nm。SVA病毒基因組從頭到尾依次為長(zhǎng)的5’端非編碼區(qū)，單一開放閱讀框（openreadingframe，ORF），短的3’端非編碼區(qū)。5’端非編碼區(qū)包含基因組相關(guān)蛋白（VPg）序列和IV型核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點(diǎn)（IRES），VPg蛋白以共價(jià)鍵與5’端非編碼區(qū)連接，在病毒增殖過程中，可通過結(jié)合起始因子參與病毒RNA的翻譯。IRES能招募核糖體對(duì)病毒RNA進(jìn)行翻譯，SVA的IRES在功能與結(jié)構(gòu)上與經(jīng)典豬瘟和乙型肝炎病毒的十分相似，這可能是由于持續(xù)感染的豬只中發(fā)生基因交換引起的。現(xiàn)已證實(shí)SVA感染豬能夠引發(fā)原發(fā)性水泡病，引起豬的鼻吻、蹄部冠狀帶的水泡病變，同時(shí)伴有跛行、厭食、嗜睡和發(fā)燒等臨床表現(xiàn)。與口蹄疫、豬水泡病和水泡性口炎引起的臨床癥狀難以區(qū)分。自2015年以來，在美國、中國、泰國等多個(gè)國家暴發(fā)了SVA疫情，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。SVA由于近些年才被發(fā)現(xiàn)，其臨床癥狀類似于口蹄疫，使得感染豬只的上市存在重大的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于SVA這樣的豬場(chǎng)新病，全世界對(duì)其認(rèn)知都比較有限，其對(duì)于豬場(chǎng)的短期和長(zhǎng)期影響難以確切估計(jì)。SVA在巴西、美國和我國幾乎同時(shí)發(fā)生，說明其從被發(fā)現(xiàn)至今，或有進(jìn)一步擴(kuò)大和爆發(fā)的可能，而作為新出現(xiàn)的疾病，其潛在影響是不可估量的，不得不引起足夠的重視。且目前該病并無成熟的商業(yè)