茶尺絨繭蜂信息化合物的誘集及其誘集劑的制備

茶尺絨繭蜂信息化合物的誘集及其誘集劑的制備

20世紀70年代以來，浙蘇安徽茶區(qū)普遍生長著茶杯和ecorp（prout），并在不同的年份重發(fā)。例如，2008年6月至9月的第三次和第五代災難發(fā)生。浙江省武義縣有1500公頃的茶園被視為光桿，植被良好的高山茶園也受到害蟲的影響。一組茶杯的病蟲害在茶園之間移動。大量被遺棄的茶園幼蟲從少數(shù)領(lǐng)導人的指導下爬上街道和山脊，并搬到可食的茶園。而該縣更香有機茶業(yè)開發(fā)有限公司數(shù)千公頃茶園基本上未受害。其有機茶園分布于植物較豐富的山林間,禁用化學防治;5月下旬春茶結(jié)束后實施重修剪以更新復壯茶樹樹勢,因為剪除了茶叢的2/3,也就抑制了茶尺蠖等害蟲種群;茶尺蠖等蟲害偶發(fā)生嚴重時,則施用植物源農(nóng)藥或礦物源農(nóng)藥。調(diào)查發(fā)現(xiàn)其茶園中天敵種類較豐富、個體數(shù)量也較大,尤其是茶尺蠖絨繭蜂Apantelessp.1和單白綿絨繭蜂Apantelessp.2。這兩種寄生蜂是茶尺蠖幼蟲期的重要寄生性天敵,在茶園中混合發(fā)生(洪北邊和殷坤山,1978;胡萃等,1979,1994;候建文和趙燁峰,1988),在大片茶園中,或在茶叢上、中、下層的小生境中,兩種絨繭蜂對茶尺蠖的跟隨效應都很顯著,但在自然條件下不足以控制茶尺蠖種群(韓寶瑜等,2006b,2007)。若能提前使用信息物質(zhì)誘集、指引絨繭蜂于茶尺蠖幼蟲種群中搜尋產(chǎn)卵,則將縮短絨繭蜂種群與茶尺蠖種群的時滯,并提高搜尋效率、增大寄生率。源于害蟲的氣味、分泌物、體表、卵表、鱗片和附腺提取物含有的利它素對寄生性和捕食性天敵昆蟲具有不同程度的引誘效應(PadmavathiandPaul,1998;韓寶瑜和周成松,2007;練永國等,2007)。通常認為,害蟲在其活動過程中雖然不時地釋放利它素,實時標明害蟲位置,但量微,可探測性小;蟲害之后,植物釋放的揮發(fā)性化合物中含有的互利素引誘天敵,量大,可探測性強(Turlingsetal.,1998;程麗坤等,2007;李繼泉等,2007)。本研究將以茶尺蠖、茶蚜ToxopteraaurantiiBoyer和假眼小綠葉蟬EmpoascavitisGothe為害茶梢揮發(fā)物(許寧等,1999;HanandChen,2002;趙冬香等,2002)、正常茶梢揮發(fā)物(李名君,2000)中典型的27種單組分、以及從正常茶梢和蟲害茶梢揮發(fā)物中選出的含量較大的3種組分的混合物和8種常見綠葉氣味的混合物為味源,先以觸角電位(electro-antennogram,EAG)反應測出活性強的組分,再選其中代表性組分進行行為測定,接著挑選活性更強的組分或?qū)⑵浠旌虾笥诓鑸@中誘集茶尺蠖絨繭蜂,為研制高效絨繭蜂誘集劑提供參考。1材料和方法1.1茶尺絨蝶蜂的飼養(yǎng)和飼養(yǎng)20世紀80年代后期以來,本研究室以新鮮茶葉逐代飼養(yǎng)茶尺蠖供試驗用,不時采集野外茶尺蠖與飼養(yǎng)茶尺蠖交配以復壯種群。生長季節(jié)分批將3日齡的1齡茶尺蠖幼蟲置于中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所試驗茶園茶樹上飼養(yǎng)5d,期間一些幼蟲被茶尺蠖絨繭蜂寄生,取回幼蟲于室內(nèi)飼養(yǎng),3齡期間比較整齊地羽化出茶尺蠖絨繭蜂,收集于若干個500mL罐頭瓶中讓其自由交尾,施以10%蜂蜜水以補充營養(yǎng)。罐頭瓶置于25℃、光周期L∶D=14∶10的光照培養(yǎng)箱中。挑選1～2日齡雌蜂供EAG試驗和行為測定。茶尺蠖絨繭蜂Apantelessp.憑證標本(voucherspecimens)保存在中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所植保研究室。1.2角態(tài)剖面試驗1.2.1液體石蠟改性的h選擇茶尺蠖、茶蚜和假眼小綠葉蟬為害前、后茶梢揮發(fā)物(許寧等,1999;李名君,2000;HanandChen,2002;趙冬香等,2002)中27種典型組分,購自Sigma公司(Sigma-Aldrich)或東京化成公司(TokyoChemicalIndustryCo.,LTD),純度均為色譜純(≥98%)(表1)。以液體石蠟為溶劑,將27種單組分分別配成10-2g/mL溶液,配制過程中使用陀螺儀充分振蕩均勻。由于蟲害前、后茶梢揮發(fā)物中芳樟醇、反-2-己烯醛和順-3-己烯-1-醇的含量都較大,且蟲害之后反-2-己烯醛的含量顯著增加,遂以3者的石蠟溶液等量混合物為味源,記為混合物1。還因新鮮茶梢散發(fā)濃烈的綠葉氣味,遂以8種常見綠葉組分反-2-己烯醛、順-3-己烯-1-醇、2-戊烯-1-醇、反-2-戊烯醛、順-3-己烯乙酸酯、正戊醇、正己醇和1-戊烯-3-醇石蠟溶液的等量混合物模擬“綠葉氣味”,記為混合物2(表1)。1.2.2觸角測試cs-05b昆蟲觸角電位儀購自Syntech公司,采用常規(guī)測試方法(Parketal.,2000)。每頭絨繭蜂只用其左側(cè)觸角,用虹膜剪刀從觸角基剪下觸角,從基部插入?yún)⒖茧姌O,再把觸角端部減去少許,套入記錄電極內(nèi),注入觸角電生理鹽水。先用液體石蠟測試,測試時從低濃度向高濃度,每次的味源刺激時間是0.5s,兩次味源刺激之間的間隔為2min,以便空氣刺激控制器(ModelCS-05b,Syntech)提供的潔凈濕潤空氣帶走供試觸角周圍的氣味及觸角恢復常態(tài)。實驗室裝有換氣扇,以排除室內(nèi)氣味。每只觸角用于測定兩種味源的10-2g/mL溶液,每種味源檢測10根觸角。得到的EAG信號經(jīng)放大器(SyntechCS-05)放大,展示于示波器上,經(jīng)Syntech軟件轉(zhuǎn)換后貯存于計算機中供數(shù)學分析。1.2.3按液體石蠟-順-3-己烯-1-醇的反應值將其作為對照的反應值,其三損害描述,將石蠟-7-氧-2-醇作為對照的條件,其符合以下情況EAG反應值參照付曉偉等(2008),EAG反應相對值=(樣品的反應值-對照的反應值)/(參照物的反應值-對照的反應值)×100%。以液體石蠟為對照,以同濃度的順-3-己烯-1-醇為參照物。28種味源10-2g/mL劑量的EAG值之間的差異用Duncan氏方法分析。1.3測試味源的選擇Y形嗅覺儀及其測定程序同韓寶瑜和周成松(2004),以引起較大EAG值的水楊酸甲酯、反-2-己烯醛、反-2-戊烯醛、苯乙酮、苯乙醇、α-萜品醇、芳樟醇和混合物1等8種代表性味源作為測試味源(表2)。其中水楊酸甲酯供試劑量為10,10-1,10-3和10-5g/mL,其余7種味源供試劑量為10-3g/mL,以液體石蠟為溶劑,分別以潔凈空氣為CK。若味源對天敵無引誘力,則天敵趨向味源和CK的百分率都是50%,便有假設(shè)測驗H0∶50∶50,選用χ2測驗分析趨向性的差異。1.4春茉莉的皮繭試驗1.4.1反-2-己烯醛誘芯生物測定條件:溫度21～24℃,濕度75%～83%,時間9:00-14:00,光照3200～3400lux,茶樹品種為群體種。以行為測定結(jié)果顯示引誘力較強的水楊酸甲酯和反-2-己烯醛為引誘試驗成分,正己烷為溶劑,配制10-3,10-2和10-1g/mL水楊酸甲酯以及10-2g/mL反-2-己烯醛溶液,再取等量10-2g/mL水楊酸甲酯和10-2g/mL反-2-己烯醛溶液均勻混合。分別將未吸附信息素的干凈橡皮頭浸于3個劑量的水楊酸甲酯、10-2g/mL水楊酸甲酯和反-2-己烯醛混合液中24h,充分吸收,制成信息素誘芯。每個誘芯附于一塊20cm×40cm芽綠粘板上,組成誘集器;同時,以浸于正己烷24h的干凈橡皮頭附于芽綠粘板上,作為對照(CK)。另一種茶尺蠖幼蟲期重要寄生蜂單白綿絨繭蜂Apantelessp.常與茶尺蠖絨繭蜂在茶園中混合發(fā)生,2008年9月5日在更香公司有機茶園、2008年8月20日在西雙版納州景洪市大渡崗茶場、2008年8月25日在云南省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所茶園、2007年10月12日在福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所茶園、2007年10月20日在廣東省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所茶園誘集茶尺蠖絨繭蜂、單白綿絨繭蜂和其他繭蜂。每次誘集時間均為24h,每種處理含有10個誘集器,誘集器間距為7m×7m。1.4.2不同誘集蜂的數(shù)量差異由于2008年9月5日在更香公司有機茶園每種處理的誘集器上均捕獲了較多的茶尺蠖絨繭蜂、單白綿絨繭蜂及其他繭蜂,且各處理間誘集的蜂數(shù)差異明顯,遂分別對每種處理的誘集器上茶尺蠖絨繭蜂和單白綿絨繭蜂、以及其他繭蜂的數(shù)量差異作Duncan氏分析。分別列出其他4次誘集試驗的每種處理的10個誘集器上誘集的茶尺蠖絨繭蜂和其他繭蜂數(shù)之和,以作比較。再列出每次試驗的每種處理的10個誘集器上誘集的茶尺蠖絨繭蜂和其他繭蜂種類數(shù),比較差異性。2結(jié)果與分析2.1單組分味源eag反應從化合物類群來看,脂肪酸衍生物引起的EAG反應較強,其次為芳香化合物和異硫氰酸酯,再次為倍半萜類,單萜類化合物的EAG反應最弱。醛類化合物引起的EAG反應強于醇類化合物引起的EAG反應。就單組分味源而言,引起較強EAG反應的為順-3-己烯乙酸酯、反-2-己烯醛、水楊酸甲酯、反-2-戊烯醛、苯乙酮、苯乙醇、苯甲醇、苯甲醛和茉莉酸甲酯;綠葉氣味中的1-戊烯-3-醇、2-戊烯-1-醇和順-3-己烯-1-醇,單萜類的香葉醇和羅勒烯,倍半萜類α-萜品烯、(+)-雪松醇、(+)-3-蒈烯和α-忽布烯,以及芳香化合物中的Z-茉莉酮和β-紫羅酮引起的EAG反應較弱。而引起最強EAG反應的是混合物1,Z-茉莉酮引起的EAG反應最弱。Duncan氏多重比較的結(jié)果表明28種味源引起的EAG反應差異顯著(表1)。2.2茶尺絨蝶蜂的趨同反應測定結(jié)果表明,用于行為反應的8種代表性味源中水楊酸甲酯、反-2-己烯醛、反-2-戊烯醛、苯乙酮和混合物1顯著地引起茶尺蠖絨繭蜂趨向反應(表2),與EAG反應的結(jié)果基本一致。在Y形嗅覺儀中,就水楊酸甲酯而言,中等劑量10-3g/mL的引誘力最強,低劑量的引誘力稍弱,高劑量則產(chǎn)生了抑制效應,引誘力也減弱。2.3水楊酸甲酯與反-2-己烯醛組合后誘效作用的比較在不同時間、不同地點誘集茶尺蠖絨繭蜂以及其他繭蜂的試驗結(jié)果表明,3個劑量的水楊酸甲酯對茶尺蠖絨繭蜂和其他繭蜂都有誘集效應,誘集效應隨著劑量的增大而增強,水楊酸甲酯與反-2-己烯醛組合之后誘效增強。3個劑量的水楊酸甲酯以及水楊酸甲酯與反-2-己烯醛組合,于2008年9月5日在更香公司有機茶園均誘集了較多的茶尺蠖絨繭蜂和單白綿絨繭蜂,這4種處理誘得的蜂數(shù)與CK誘得的蜂數(shù)之間的差異顯著(表3)。3茶嗪對茶樹國土誘變的誘變效果蟲害誘導植物釋放揮發(fā)性互利素、或改變揮發(fā)物各組分的相對比例而引誘天敵,這些植物揮發(fā)物的釋放量大、傳播距離遠,易被天敵覺察,在天敵對寄主的定位過程中起著重要的作用(Turlingsetal.,1998;程麗坤等,2007;李繼泉等,2007)。因此,就人為使用信息素誘集寄生蜂趨向于高密度害蟲種群而言,植物揮發(fā)物可著重考慮。桑天牛Aprionagermari(Hopp)為害之后,桑枝氣味對長尾嚙小蜂AprostocetusprolixusLaSalleetHuang的引誘作用增強,桑天牛產(chǎn)卵枝的揮發(fā)物引誘作用更強(李繼泉等,2007),因此桑天牛的為害誘導桑樹釋放了特異性的氣味。重度產(chǎn)卵危害馬尾松樹干與取食危害樹枝萜烯中,α-烯、β-蒎烯、檸檬烯和β-水芹烯相對含量差異顯著(寧眺等,2006)。受茶尺蠖的為害誘導,茶樹釋放較多的C5、C6醛類,如本研究中的反-2-己烯醛和反-2-戊烯醛,引起單白綿絨繭蜂較強的EAG反應(許寧等,1999)。假眼小綠葉蟬為害之后,茶樹釋放較多的反-2-己烯醛和吲哚等,在行為測定中顯著地引誘白斑獵蛛Evarchaalbaria(L.Koch)(趙冬香等,2002)。茶蚜為害可誘導茶樹釋放較多的苯甲醛、反-2-己烯醛和吲哚(HanandChen,2002),強烈地引起七星瓢蟲CoccinellaseptempunctataL.、中華草蛉ChrysopasinicaTjeder和蚜繭蜂Aphidiussp.的EAG和行為反應。本課題組還發(fā)現(xiàn)假眼小綠葉蟬或茶尺蠖為害福鼎大白茶品種之后,茶樹釋放較多的水楊酸甲酯和反-2-己烯醛,引起七星瓢蟲、中華草蛉、蚜繭蜂和大草蛉ChrysopaseptempunctataWesmael強烈的行為反應(韓寶瑜等,2006a)。用Y形嗅覺儀進行的行為測定結(jié)果(Shimodaetal.,2002)和田間誘集天敵試驗(JamesandPrice,2004)皆證明水楊酸甲酯對天敵昆蟲的誘集活性較強。七星瓢蟲以水楊酸甲酯作為互利素定位大豆蚜AphisglycinesMatsumura(ZhuandPark,2005)。茶尺蠖、葉蟬和茶蚜的為害誘導茶樹釋放反-2-己烯醛、反-2-戊烯醛、吲哚、苯甲醛和水楊酸甲酯作為互利素,引誘天敵,也可引起茶尺蠖絨繭蜂較強烈的EAG和行為反應。所以,本研究也證實了蟲害可誘導植株釋放特異性化合物(即互利素)而引起寄生蜂強烈的趨向反應。健康植株揮發(fā)物中的正辛醇和香葉醇顯著地引誘門氏食蚜蠅SphaerophoriamenthastriL.和大草蛉ChrysopaseptempunctataWesmael(韓寶瑜和周成松,2004),順-3-己烯-1-醇、順-3-己烯乙酸酯、1-辛烯-3-醇和辛醇引起蠶飾腹寄蠅Blepharipazebina(Walker)雌蠅較強的EAG反應(徐延熙等,2007)。正常桑枝氣味對長尾嚙小蜂也有引誘作用,可指引該小蜂找到桑樹群落(李繼泉等,2007)。順-3-己烯乙酸酯、苯乙醇和苯甲醇是新鮮茶梢香氣的主要組分(李名君,2000);苯乙酮是茶花香氣的主要組分,在每個茶樹品種的茶花