山楂片還原糖測定方法的研究

山楂片還原糖測定方法的研究

山楂片以中國獨(dú)特的山楂果實為主要材料，添加一定的糖，使其變成紅色的蜂蜜?？诟辛己们揖哂泻芎玫乃幱脙r值,深受廣大消費(fèi)者的歡迎。加工包裝好的山楂片在儲存和流通過程中,其所含有的還原糖如葡萄糖、果糖,在有氨基化合物的條件下,會發(fā)生一系列階段性反應(yīng),即美拉德反應(yīng),導(dǎo)致山楂片發(fā)生褐變,并且隨著美拉德反應(yīng)時間的延長,褐變程度也加深,因此準(zhǔn)確測定山楂片中的還原糖含量對于山楂片的保質(zhì)及包裝研究具有重要意義。目前用于測定山楂片中還原糖含量的方法主要有GB/T5009.7-2008中規(guī)定的直接滴定法和高錳酸鉀滴定法,這兩種方法操作較復(fù)雜,試劑繁多有腐蝕性,且易受人為因素干擾,而DNS法操作簡便快捷,消耗試劑少,準(zhǔn)確性能達(dá)到分析要求,應(yīng)用廣泛。但是采用DNS測定還原糖,測定條件不一,影響山楂片中還原糖測定的準(zhǔn)確性,因此采用DNS測定山楂片中的還原糖時,需通過實驗確定影響測定還原糖的關(guān)鍵因素,為山楂片中還原糖的快速測定條件提供參考。1材料和方法1.1化學(xué)試劑及儀器葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液自制;3,5-二硝基水楊酸(DNS)液自制;Aka牌山楂片購自麥德龍超市,生產(chǎn)日期為2012年1月17日;3.5-二硝基水楊酸(DNS)、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、亞硫酸鈉、苯酚、葡萄糖國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純。2802UV/VIS分光光度計尤尼科(上海)儀器有限公司;AB204-N分析天平(0.0001g)上海世義精密儀器有限公司;YJ501超級恒溫水浴鍋金壇市榮華儀器有限公司。1.2實驗方法1.2.1研缽研成泥狀液的制備將山楂片置于研缽中,充分搗碎混勻,稱取5g(精確自0.001g),加入與樣品等質(zhì)量的水,用研缽研成泥狀,再全部轉(zhuǎn)移至燒杯中,加入煮沸冷卻至80℃的蒸餾水,趁熱過濾,收集濾液并定容至100mL。1.2.2酒石酸鉀溶液準(zhǔn)確稱取3,5-二硝基水楊酸6.3g,溶于500mL蒸餾水中,加熱,于熱溶液中依次加入酒石酸鉀鈉182g,氫氧化鈉21g,苯酚5g,亞硫酸鈉5g,攪拌至完全溶解,冷卻后用蒸餾水定容至1000mL,貯于棕色瓶中備用,室溫下放置7d后使用。1.2.3葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的制備將無水葡萄糖烘干至恒重,精確稱量100mg,用蒸餾水溶解,并定容至100mL,配制成1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液以備用。精確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL,分別置于25mL的具塞試管中,均補(bǔ)水至2mL,再加入DNS溶液2mL,混合均勻后,沸水浴5min,迅速流水冷卻,加水至刻度線?？瞻渍{(diào)零,以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo),吸收度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.2.4ds試劑掃描準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和蒸餾水各1.0mL,分別加入到25mL具塞試管中,加入DNS試劑2mL,混合均勻后沸水浴加熱5min,迅速流水冷卻,加水至25mL,再將葡萄糖顯色液+蒸餾水(空白)、DNS試劑+蒸餾水(空白)、葡萄糖顯色液+DNS(空白)試劑分別在波長為460~600nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。1.2.5ds試劑用量的確定用移液管準(zhǔn)確吸取4mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液加入到編號為1~7的25mL具塞試管中,分別加入1、1.5、2、2.5、3、3.5、4mLDNS試劑,沸水浴加熱5min,流水冷卻再定容,在550nm波長下測定其吸光值。1.2.6水浸浴加熱時間分別吸取2mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液加入到編號為1~10的25mL具塞試管中,各加入2mLDNS,并分別在沸水浴中加熱3、4、5、6、7、8、10、12、14、16min,流水冷卻定容,在550nm波長下測定其吸光值。2結(jié)果與分析2.1檢測波長的確定DNS法測定還原糖,即3,5-二硝基水楊酸在堿性條件下,與還原糖生成3-氨基-5-硝基水楊酸,這種物質(zhì)在煮沸條件下呈棕紅色,并且,在一定條件下,還原糖含量越多,顏色越深,吸光值越大。由圖1可以看出,最大吸光值的波長為500nm,通常情況下應(yīng)該選擇吸光值最大時的波長,但是在500nm處DNS試劑+蒸餾水也具有一定的吸光值,并且,整個實驗過程中,DNS試劑的添加量都一樣,但是由于待測液中的還原糖與DNS試劑相結(jié)合,使得空白中DNS試劑的量大于待測液中DNS試劑的量,對吸光值的測定也有一定的影響,因此檢測波長不選500nm。從圖1還可以看出,DNS試劑+蒸餾水在波長≤540nm時,都有一定的吸光值,而在550nm以后,DNS試劑+蒸餾水的吸光值接近于0,在排除其他的因素的影響外,選擇最大吸光值處的波長為檢測波長,即550nm。2.2吸光度的穩(wěn)定性由圖2可以看出,隨著DNS試劑用量的增加,吸光值增大,當(dāng)DNS用量在2~3mL時,吸光度值比較穩(wěn)定,浮動較小。因此,為了減小DNS試劑對吸光值測定的影響,DNS試劑的用量不應(yīng)該小于2.0mL,在山楂片中還原糖測定時,DNS試劑的用量采用的是2.0mL。2.3浴時間及吸光度由圖3可以明顯看出,在一定可見范圍內(nèi),隨著沸水浴時間的增長,吸光度增大。當(dāng)沸水浴加熱時間增加到5min后,吸光度變化趨于穩(wěn)定,說明顯色反應(yīng)基本全部完成,故選擇5min作為最佳顯色反應(yīng)時間。2.4吸光度與線性關(guān)系從圖4中可以看出,葡萄糖的含量和相應(yīng)的吸光度數(shù)值之間有一定的線性關(guān)系,其回歸方程為:y=0.656x+0.076,R2=0.9927,線性關(guān)系良好。2.5方法研究2.5.1儀器的整體穩(wěn)定性取同一樣品溶液連續(xù)測定10次,其吸光度值分別為0.502、0.498、0.500、0.501、0.501、0.502、0.499、0.501、0.504、0.501,其數(shù)值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.166%,說明儀器精確度良好,如表1所示。2.5.2重復(fù)實驗取同一批樣品溶液3份,按照2.4中的方法進(jìn)行重復(fù)實驗,結(jié)果RSD=0.568%,表明該實驗的重復(fù)性良好。2.5.3還原糖質(zhì)量的測定準(zhǔn)確吸取山楂片提取液1mL,按2.4連續(xù)測定3批樣品,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出還原糖的質(zhì)量分別為3.762、3.748、3.756mg/100mg,RSD=0.496%。3測定波長的確定關(guān)于應(yīng)用3,5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量時所用波長的選擇一直爭論不休,不同的植物就有不同的選擇,朱海霞等研究馬鈴薯還原糖中確定的波長為510nm,羅志剛等在測定煙草還原糖含量時使用的波長為474nm,王俊剛等在甘蔗莖節(jié)還原糖測定中確定的波長為510nm,齊香君等在細(xì)菌纖維素發(fā)酵的還原糖測定中使用的波長為483nm,這些都與通用的540nm有一定的出入。其原因可能是儀器限制、還原糖含量以及DNS用量等因素的影響,因