幽門螺桿菌疫苗的研究進展

.頁眉.頁腳..綜述幽門螺桿菌疫苗的研究進展摘要:幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,HP)是一種革蘭氏陰性螺旋桿菌，能夠?qū)е挛秆?、胃和十二指腸潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴瘤和胃癌。1994年，和HP被世界衛(wèi)生組織（ＷＨＯ）列為Ⅰ類致癌原。此外,ＨP還與糖尿病、冠心病、血小板減少性紫癜等一些腸道外疾病有重要關(guān)系。目前ＨP感染的主要治療方案是聯(lián)合應(yīng)用質(zhì)子泵抑制劑、鉍劑和抗生素的三聯(lián)療法，殺滅細菌效率超過９０％。但是，這種治療方案仍存在以下問題：藥物療法副作用較多，如口腔異味、腹痛、惡心、嘔吐等；抗生素耐藥菌株的不斷增多；對于發(fā)展中國家感染人群來說治療費用相對昂貴等。免疫接種有望成為預防ＨP感染最有效最經(jīng)濟的方法(1)。近年來,HP感染呈上升趨勢,有效疫苗的研制是根除HP的最簡單、經(jīng)濟、快捷的手段。隨著疫苗研究的深入,諸如滅活全菌疫苗、亞單位疫苗、載體疫苗、DNA疫苗及緩釋疫苗等相繼問世,其優(yōu)、缺點也比較明顯。本文對以上幾種疫苗的研究進展作一綜述。關(guān)鍵詞：幽門螺桿菌疫苗一.研究幽門螺桿菌疫苗的迫切性(Heli-cobacterpylori,HP)確認為一級致癌因子,但長期以來對HP感染的藥物治療一直受到治愈率低、費用昂貴、病人依從性差及耐藥菌株出現(xiàn)等諸多因素的制約,使現(xiàn)階段全球感染人數(shù)仍呈上升趨勢。HP疫苗的研制和應(yīng)用對有效控制及降低HP感染率、發(fā)病率會起到舉足輕重的作用(2)。二．Hpylori疫苗開發(fā)策略由于Hpylori僅感染胃上皮細胞表面,它們的發(fā)病由病原菌的粘附、定居和繁殖所決定,其感染局限于循環(huán)抗體難以達到的地方。因此,這類疫苗應(yīng)主要著眼于產(chǎn)生分泌性抗體,阻止細菌對胃粘膜上皮細胞的粘附。這種疫苗以經(jīng)血循環(huán)途徑給予通常是無效的,疫苗只是通過與感染相同的途徑給予,才能在通常的感染部位誘導出足夠的分泌型抗體。疫苗接種應(yīng)能誘導針對大量表面蛋白的強烈的粘膜免疫應(yīng)答。而疫苗引起的免疫主要針對Hpylori開始粘附過程的關(guān)鍵性抗原結(jié)構(gòu),即阻斷Hpylori在胃粘膜的粘附。Hpylori的毒力因子有許多種,如尿素酶、熱休克蛋白、VacA、CagA、過氧化氫酶等,從理論上講,不大可能運用“減法”策略研制一種成功的減毒疫苗,因此,“加法”策略是Hpylori疫苗研究過程中應(yīng)用的最佳選擇。由此可見,Hpylori疫苗開發(fā)策略必須建立在經(jīng)充分鑒定的、高度保守的純化抗原上,并能誘導有效的粘膜免疫應(yīng)答。三.幽門螺桿菌疫苗的進展1.HP全菌滅活菌苗Czinn和Nedrud首先證實Hpylori全菌蛋白抗原聯(lián)合霍亂毒素(CholeraToxin,CT)可預防小鼠和雪貂感染Hpylori,并表明預防性疫苗與胃腸道IgG和IgA反應(yīng)有關(guān)。1999年Goto等用超聲處理的Hpylori悉尼株全菌抗原+CT口服接種C57BL/6小鼠,取胃組織做細菌培養(yǎng)和組織學檢測,結(jié)果被免疫小鼠Hpylori定植減少90-100%,粘膜組織的Hpylori特異性IgA抗體水平顯著升高;然而,免疫組與對照組相比出現(xiàn)了更嚴重的胃炎,以明顯的單核細胞浸潤為特征。Doidge等首次提出Hpylori全菌超聲物作為治療性疫苗的可行性。他們用Hpylori超聲破碎物加CT治療感染Hpylori的小鼠,根治率達90%。Ghiara等用Hpylori細胞超聲物加去毒LT(LTK63)治療小鼠Hpylori相關(guān)慢性胃炎,根治率50%。這些研究均是針對短期內(nèi)感染Hpylori的治療效果。最近,Ikewaki等的研究表明Hpylori全菌抗原還可以治療Hpylori長期感染。因為使用全菌抗原存在因交叉反應(yīng)引起的一系列不良反應(yīng)的可能性。因此,Hpylori疫苗的后期研究主要集中在尋找有效、安全的保護性抗原上,其中保護效果比較理想的要數(shù)尿素酶（3）。2.亞單位疫苗(1)熱休克蛋白由于Hpylori的毒力因子尚不完全清楚，已發(fā)現(xiàn)的有許多種，因此，“加法”策略(組分苗或基因工程亞單位苗)在Hpylori疫苗的研究過程是最佳選擇。隨著Hpylori全基因序列的公布，以及分子克隆技術(shù)的日臻成熟，Hpylori疫苗保護性抗原的制備已由組分提取轉(zhuǎn)向基因工程亞單位疫苗的研制。利用基因工程的方法獲得抗原具有諸多優(yōu)點:高效、經(jīng)濟、無毒、快速、避免Hpylori培養(yǎng)的繁瑣過程、便于大量生產(chǎn)等，因此基因工程亞單位疫苗已經(jīng)成為Hpylori疫苗研究的主要方向。HsPA是HsP的主要功能單位，具有免疫原性且位于細菌表面，相對保守，有望成為Hpylori亞單位疫苗的重要組分之一?，F(xiàn)已成功構(gòu)建了鄭州分離Hpylori菌株MEL-HP27和國際標準菌株NCTCI1637hsPA基因的重組質(zhì)粒。測序結(jié)果顯示hsPA基因全長為357bp，編碼118個氨基酸的膚鏈，其中NCTCll637hsPA基因序列與Genbank上完全一致，說明本研究的克隆基因具有相當高的保真性。利用生物學軟件對HpyloriMEL-HP27菌株的hsPA基因序列與GenBank公布的4株Hpylori相應(yīng)基因序列進行比較，同源性在95.20%-97.48%，與國內(nèi)其他學者的比較結(jié)果相似。但由于氨基酸簡并行的存在，MEL一HP27與GenBank公布的4株HpyloriHsPA的氨基酸序列同源性在95.76%-97.46%。而且，MELHP27的HspAC一端8個組氨酸殘基未發(fā)生改變，這一特殊結(jié)構(gòu)為下一步HsPA蛋白的準確表達以及其免疫學活性的研究提供了保證（4）。(2).脲酶尿素酶(urease，ure)的主要活性部分位于Hpylori胞膜表面，在Hpylori菌體蛋白中含量豐富(占Hpylori可溶性蛋白總量的6%)，廣泛表達和高度保守。此外，它的大分子量和顆粒結(jié)構(gòu)有利于私膜免疫接種，具有高度的免疫原性，可以引起強烈的免疫應(yīng)答。ure具有ureA和ureB兩個亞單位，兩個亞單位均有免疫原性和免疫保護性，但ureB的作用強于ureA。因此,ureB分子是重要的H.Pylori候選疫苗抗原(5)。熱休克蛋白A亞單位(heatshockproteinsubunitA,HspA)與尿素酶B亞單位(ureasesubunitB,UreB)的協(xié)同作用在Marchetti等的實驗里得到了證實。構(gòu)建的HspA-UreB融合蛋白已被證實具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性,HspA-UreB聯(lián)合抗原作為幽門螺桿菌疫苗的候選抗原應(yīng)具有廣闊的應(yīng)用前景（6）。對HPHspA-UreB融合蛋白在不同條件下誘導表達的情況進行了探索,確定了該融合蛋白合適的表達條件。研究結(jié)果表明,在相同溫度和培養(yǎng)基中,誘導表達的效率取決于誘導劑的濃度和誘導時間,不同的培養(yǎng)基中,適宜的誘導劑濃度也不同。從目的蛋白在全菌蛋白中的含量上看,溫度為37℃時,LB培養(yǎng)基中,0·3mmol·L-1的IPTG濃度誘導5h時融合蛋白的含量最高為21.51%;而在25℃時,以在SOC培養(yǎng)基中,1.0mmol·L-1的IPTG濃度誘導8h時融合蛋白的含量最高為17.28%。但從可溶性蛋白表達量的角度考慮,HspA-UreB融合蛋白在后者超聲破碎上清中含量達34.58%,可溶性蛋白的產(chǎn)量無論是在絕對量上,還是在相對量上均高于其他條件下的產(chǎn)量,這就說明25℃時,在SOC培養(yǎng)基中較為有效地抑制了折疊中間體的形成,提高了表達系統(tǒng)表達可溶性蛋白的產(chǎn)量。另外,在相同條件下,LB培養(yǎng)基中,葡萄糖含量越高目的蛋白表達量越低,這可能與葡萄糖的存在對目的蛋白的表達有抑制作用有關(guān)。對誘導表達的全菌蛋白做Westernblotting鑒定,結(jié)果在預測的相對分子量(82100)處得到了特異的反應(yīng)帶,從而證實目的蛋白具有良好的免疫學活性,可以作為候選抗原進一步應(yīng)用于HP疫苗和診斷性抗原的研制中（7）。3.載體疫苗及佐劑的研究蛋白疫苗的制備步驟繁瑣,費時費力,而且需加以佐劑才能發(fā)揮較好的免疫效力,在口服給藥免疫過程中還不可避免地被胃酸及胃蛋白酶破壞,從而造成大量的疫苗有效成分喪失。經(jīng)過對載體疫苗的研究,發(fā)現(xiàn)其因諸多優(yōu)點而越來越受到人們的重視:現(xiàn)研究的有：減毒沙門菌載體疫苗、大腸桿菌載體疫苗、病毒載體疫苗。Hpylori通常是胃黏膜組織的局部感染,其抗感染能力取決于粘膜免疫力,這決定了口服Hpylori疫苗是最有效的免疫途徑。雖然單獨口服保護性抗原也具有一定的免疫原性和免疫效應(yīng),但實驗已證明輔以佐劑能增強免疫效果。較理想的黏膜佐劑應(yīng)該高效、安全,能激活黏膜免疫系統(tǒng),在其存在的情況下抗原經(jīng)黏膜供給可引發(fā)抗原特異性全身和黏膜的體液和細胞介導的免疫應(yīng)答,同時能避免誘導黏膜耐受。目前,CT和LT兩種腸毒素被認為是最有效的黏膜佐劑,但是它們的毒性限制了在人體的使用。利用基因工程構(gòu)建的LT無毒衍生物突變體能夠彌補這樣的不足,LT第63位氨基酸突變,使絲氨酸改變?yōu)橘嚢彼?使得LTA失去NAD蛋白結(jié)合位點,經(jīng)研究證實為無毒且具有較強的免疫原性和佐劑性。研究免疫實驗動物時,選用了在大腸桿菌中表達和純化出大腸桿菌不耐熱腸毒素無毒突變體mLT63融合蛋白作為免疫佐劑。國內(nèi)外的一些研究表明,Hpylori黏附素中的一些蛋白成分具有良好的抗原活性,可誘導出很強的菌株特異性免疫反應(yīng),其中Hpylori黏附素A(HpyloriadhesionA,HpaA)由HpaA基因編碼,為細菌鞭毛鞘膜蛋白,幾乎存在于所有臨床分離Hpylori菌株的表面,是該菌的主要黏附因子,且氨基酸序列高度保守,動物實驗已證明HpaA是Hpylori定植的必要因子,基本符合理想保護性抗原的要求。用純化的HpaA蛋白經(jīng)背部皮下和腹腔注射免疫實驗小鼠,ELISA、Westenblot方法檢測和評價免疫小鼠血清中相應(yīng)抗體,表明純化蛋白具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性。采用純化后的HpaA蛋白聯(lián)合黏膜免疫佐劑mLT63灌胃免疫小鼠,Hpylori攻擊感染后,評價免疫保護效果。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗原免疫實驗組之間保護率差異不具有統(tǒng)計學意義,提示HpaA和傳統(tǒng)的UreB抗原免疫保護效果相當,均高于實驗對照組,差異具有統(tǒng)計學意義。HpaA蛋白能夠顯著減少Hpylori在小鼠胃內(nèi)的定植,產(chǎn)生了一定的免疫保護性,為研究幽門螺桿菌疫苗篩選免疫保護性蛋白提供了有意義的依據(jù)(8)。4、雙價疫苗(1)幽門螺桿菌UreB與Omp11雙價疫苗近年來研究者發(fā)現(xiàn)了多種幽門螺桿菌(Helico-bacterpylor,iHp)的有效保護性抗原成分,如UreB、Omp、Hsp、NAP等,其中尿素酶、外膜蛋白等是人們研究的焦點。已有大量研究證實UreB有較好的免疫保護效果,而且已有研究將UreB疫苗制劑進入到二期臨床試驗。相當多的革蘭陰性細菌外膜蛋白被證實具有較好的抗原活性,可誘導出很強的特異性免疫反應(yīng),這些外膜蛋白作為抗體和免疫細胞攻擊的主要靶標,可以介導對細菌最直接有效的殺滅作用,是決定免疫反應(yīng)是否對人體具有保護性的關(guān)鍵因素,Omp11是Hp的一種外膜蛋白,其編碼基因具有高度保守性,為重要的免疫抗原。為克服單一抗原分子誘導的免疫保護水平偏低的問題,作者將ureB與omp112個基因進行融合,并插入原核表達載體pMAL-c2X中,構(gòu)建獲得了融合蛋白的高效表達，為Hp基因工程疫苗的研制奠定基礎(chǔ)(9)。(2)幽門螺桿菌Hspa-UreB雙價疫苗在疫苗抗原的研究中,應(yīng)用生物信息學技術(shù)可以對僅知道編碼基因的蛋白質(zhì)進行結(jié)構(gòu)與抗原活性的預測和分析,對這些蛋白進行初步的篩選,從而提高疫苗候選抗原篩選工作的效率。由于融合蛋白HspA-UreB可以看作是一種新的蛋白,因此作者利用生物信息學軟件對其生化特性、抗原性以及空間結(jié)構(gòu)進行了預測。分析結(jié)果顯示,該融合蛋白具有典型抗原分子的結(jié)構(gòu)特征,有望成為新的Hpylori疫苗候選抗原,為本課題組下一步研究融合蛋白的表達及其免疫學活性奠定了基礎(chǔ)（10）。Ferrero等證明熱休克蛋白A亞單位(heatshockproteinsubunitA,HspA)與尿素酶B亞單位(ureasesubunitB,UreB)組合的疫苗在小鼠中獲得100%的保護率,這無疑提示構(gòu)建重組HspA-UreB融合蛋白具有廣闊的應(yīng)用前景(11)。四.結(jié)語及展望經(jīng)過大量的研究，目前己確立了多種保護性抗原,且不斷有新的抗原被發(fā)現(xiàn),有些疫苗己進入Ⅱ期臨床試驗,為今后Hpylori的預防和治療工作開辟了廣闊的前景。但在疫苗的研究中仍存在許多問題,并亟待解決。1、仍需進行深入研究,以確定最為保守、有效、安全的保護性抗原,促進開發(fā)有效的疫苗。2、單價抗原疫苗的保護效果并不十分理想,多種抗原聯(lián)合制備雙價或多價疫苗將是今后Hpylori研究的主要方向。3、需一種無毒、高效、安全的粘膜佐劑以增強抗原的免疫效應(yīng)?？傊?在Hpylori疫苗的研制過程中,還需不斷的努力，不斷地改進試驗方法,從而開發(fā)出更加安全、有效和經(jīng)濟的疫苗,服務(wù)于人類?！緟⒖嘉墨I】[1]張小娟,張榮光,段廣才,范青堂.幽門螺桿菌抗原基因ｕｒｅＢ在乳酸菌中的克隆表達與免疫反應(yīng)性研究(J).中國人獸共患病學報,2011,(10):925-926.[2]王毅超.幽門螺桿菌疫苗的研究進展（J）.國外醫(yī)學藥學分冊,2004,（04）第31卷第2期：97.[3]代麗萍,段廣才.幽門螺桿菌疫苗保護性抗原研究現(xiàn)狀及展望(J).胃腸病學和肝病學雜志,2002（06）第11卷第2期：100[4]代麗萍,段廣才,郗園林,范清堂.幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位編碼基因的克隆與序列分析(J).胃腸病學和肝病學雜志,2004（12）第13卷第6期：571.[5]代麗萍,段廣才,郗園林,范清堂.幽門螺桿菌