抗人cea小分子嵌合抗體rch24fab2在結(jié)腸癌裸鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布及放射免疫顯像

抗人cea小分子嵌合抗體rch24fab’2在結(jié)腸癌裸鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布及放射免疫顯像

99mt具有良好的核物理性能、高的核譜純度、適宜的能量和半衰期、方便、易于控制的功效，所以它可以用來(lái)成像人體的重要器官。現(xiàn)在，它是顯示顯示醫(yī)學(xué)表現(xiàn)的最常用的放射性核素。99mTc標(biāo)記化合物的放射性診斷藥物已占核醫(yī)學(xué)診斷用藥的80%以上,廣泛用于多種臟器疾病和惡性腫瘤的檢查。然而,99mTc標(biāo)記的惡性腫瘤診斷藥物仍以標(biāo)記小分子化合物為主,作為形態(tài)或功能顯影劑用于顯示病變組織的形態(tài)、代謝狀態(tài)、乏氧狀態(tài)等,例如常用的99mTc-MIBI、99mTc-MDP、99mTc-DMSA、99mTc-HL91等[1~4]。雖然99mTc標(biāo)記小分子化合物具有良好的組織穿透性能,但缺乏特異性。因此,上述99mTc標(biāo)記小分子化合物診斷藥物在臨床惡性腫瘤的診斷中仍存在特異性差、誤診率高等不足。單克隆抗體是目前公認(rèn)的特異性較強(qiáng)的分子探針,其在體內(nèi)與表達(dá)特定表面抗原的腫瘤細(xì)胞結(jié)合。CEA抗原是腫瘤細(xì)胞表面重要的標(biāo)志物之一,尤其是在結(jié)直腸癌,是目前較優(yōu)異的腫瘤特異診斷靶標(biāo)。我們采用99mTc標(biāo)記抗人CEA小分子嵌合抗體Rch24F(ab’)2制備了惡性腫瘤分子顯影劑,并利用荷人結(jié)腸癌裸鼠模型研究其在體內(nèi)的生物學(xué)分布和腫瘤顯像效果,探討其在CEA陽(yáng)性的惡性腫瘤放射免疫分子顯像診斷中的可行性和應(yīng)用前景。1材料和方法1.1細(xì)胞株和背景人CEA抗原購(gòu)自MeridianLifeScience公司;抗人HRP-IgGFab購(gòu)自Sigma公司;低IgG胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司;ProteinGSepharose4BFastFlow購(gòu)自AmershamPharmacia公司;快速薄層層析-硅膠紙(ITLC-SG)購(gòu)自Gelman公司;γ相機(jī)為荷蘭ADACTHYRUS型。抗人CEA小分子嵌合抗體Rch24F(ab’)2高表達(dá)的CHO細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存。6周齡Babl/c裸鼠,由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院動(dòng)物室提供。1.2方法1.2.1高效mdg的制備抗人CEA小分子嵌合抗體Rch24F(ab’)2高表達(dá)的CHO細(xì)胞采用含5%低IgG胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng),收集上清,用ProteinGSepharose4BFastFlow親和純化得到高純度抗體。1.2.2蓮花手稿的動(dòng)物模型建設(shè)2×106人結(jié)腸癌細(xì)胞LS180接種于裸鼠右前腋下,10d后腫瘤直徑可達(dá)0.5~1cm,備用放射免疫顯像研究。1.2.3抗膽紅素測(cè)定和測(cè)定的效率以及放化純度采用SnCl2直接還原法標(biāo)記抗體,快速薄層層析(ITLC)法測(cè)定抗體的標(biāo)記效率和放化純度。1.2.4標(biāo)記抗體的免疫活性測(cè)定包被人CEA抗原2μg/ml經(jīng)2%BSA封閉,加入不同稀釋度的標(biāo)記前和標(biāo)記后抗體,加入抗人IgG(Fabspecific)酶標(biāo)二抗,顯色、終止,測(cè)OD450,并計(jì)算標(biāo)記抗體的免疫活性。免疫活性=(未標(biāo)記抗體OD450-標(biāo)記抗體OD450)/未標(biāo)記抗體OD450×100%。1.2.5單位重量組織放射性t/nt將標(biāo)記抗體99mTc-Rch24F(ab’)2加入0.9%生理鹽水或5%人血清白蛋白中,經(jīng)37℃孵育24h,ITLC法測(cè)定標(biāo)記物中99mTc的脫落率。1.2.699mTc-Rch24F(ab’)2在荷瘤裸鼠體內(nèi)生物學(xué)分布選取荷人結(jié)腸癌裸鼠15只隨機(jī)分成5組,每組3只,經(jīng)尾靜脈注射99mTc-Rch24F(ab’)2,18.5MBq(0.1ml)/只,分別在3h、8h、12h、24h以及48h斷頸處死,取腫瘤和血液、心、肝、肺等主要臟器,稱重并測(cè)量放射性計(jì)數(shù),計(jì)算單位重量組織放射性占注射劑量的百分比(ID/g)和腫瘤與正常組織的放射性比值(T/NT)。1.2.799mTc-Rch24F(ab’)2在荷瘤裸鼠體內(nèi)放射免疫顯像取荷人結(jié)腸癌裸鼠8只,經(jīng)尾靜脈注射99mTcRch24F(ab’)2,37MBq(0.20ml)/只,分別在2h、3h、5h、7h以及24h麻醉,俯臥固定,置于γ相機(jī)下,能量140Kev,窗寬30%,矩陣128×128,針孔準(zhǔn)直器,采集計(jì)數(shù)5×104顯像。2結(jié)果2.19小鼠血清未良反應(yīng)、t/nt含量親和純化的Rch24F(ab’)2純度>93%。99mTcRch24F(ab’)2標(biāo)記率為90%,放化純度>95%,放射比活為840MBq/mg。免疫活性為65.7%。99mTc-Rch24F(ab’)2在37℃孵育24h,在生理鹽水或人血清白蛋白溶液中,放射性脫落均<5%,表明標(biāo)記物在體外穩(wěn)定。經(jīng)尾靜脈注射99mTc-Rch24F(ab’)23h后,小鼠腫瘤與除血液、腎臟、脾臟及肝臟外各臟器T/NT比值均>0.80。8h后,腫瘤與除腎臟、脾臟及肝臟外臟器的T/NT比值均>1,其中12h時(shí)腫瘤與肌肉和腸腔的T/NT分別為11.09和5.12(Table1)。在3~8h內(nèi),99mTc-Rch24F(ab’)2即可顯示出較高的T/NT比值。3h后,腫瘤的攝入量ID/g為2.55,隨著時(shí)間延長(zhǎng),攝入量在24h內(nèi)維持在一個(gè)較高的水平,12h時(shí)ID/g為3.00。但其余臟器隨著時(shí)間的延長(zhǎng)攝入量逐漸減少,其中腸腔ID/g由3h的1.56降至12h的0.63。48h時(shí),除腎臟、肝臟攝取劑量仍大于腫瘤外,其余各臟器攝取劑量均小于腫瘤(Table2)。2.39腫瘤的成像及圖像尾靜脈注射99mTc-Rch24F(ab’)22h后腫瘤即可成像,腫瘤區(qū)域可見(jiàn)明顯濃聚。3h后腫瘤圖像清晰并逐漸加強(qiáng)。5~24h,腫瘤圖像均保持清晰。結(jié)果顯示對(duì)于最大徑達(dá)0.5cm的腫瘤可獲得清晰的圖像(Figure1)。3明確了最佳成像目標(biāo)的/3fab>b]b99mTc標(biāo)記的小分子化合物診斷藥物作為形態(tài)或功能性顯影劑已廣泛用于臨床惡性腫瘤的診斷、前哨淋巴結(jié)的探測(cè)等,但小分子化合物與惡性腫瘤細(xì)胞的結(jié)合往往存在親和力不足、特異性差的缺陷,導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性產(chǎn)生,誤診率較高。分子影像技術(shù)作為近年來(lái)腫瘤影像醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要趨勢(shì)之一,為在分子水平判定病灶性質(zhì)提供了可能性。近十余年來(lái)不少學(xué)者將99mTc標(biāo)記的單克隆抗體應(yīng)用于疾病診斷中,尤其是在血液系統(tǒng)腫瘤和自身免疫疾病的診斷。雖然單克隆抗體是具有高特異性和親和力的分子結(jié)合探針,然而99mTc標(biāo)記藥物在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)卻面臨兩個(gè)問(wèn)題:一是分子量較大,其靶向分布和體內(nèi)代謝所需的時(shí)間均較長(zhǎng),與99mTc僅約6h的半衰期沖突;二是鼠單克隆抗體具有異源性,可引起毒副反應(yīng)。在本研究中,我們采用保留了完整抗腫瘤抗體分子的具有高特異性和高親和力的F(ab’)2小分子抗體,減少約1/3的分子量和去除影響抗體半衰期的Fc片段,以改善標(biāo)記物的靶向分布和體內(nèi)代謝,并且通過(guò)使用人—鼠嵌合小分子抗體減少其毒副反應(yīng)。我們采用99mTc標(biāo)記Rch24F(ab’)2抗體在荷人結(jié)腸癌裸鼠模型中研究該分子顯影劑的體內(nèi)的生物分布的結(jié)果表明,在我們觀測(cè)的時(shí)間范圍內(nèi)(3h~48h),除了肝、脾、腎這3個(gè)臟器之外,99mTc標(biāo)記的Rch24F(ab’)2抗體T/NT比值均大于1,并呈逐步上升趨勢(shì)。12h時(shí)多個(gè)臟器的T/NT比值達(dá)到相對(duì)最高值,肌肉與腸腔的T/NT比值分別達(dá)到11.09和5.12,表明99mTc標(biāo)記的Rch24F(ab’)2抗體呈顯著的腫瘤靶向性生物分布特征,其優(yōu)良的T/NT比值預(yù)示了其顯像時(shí)將具有良好的效果。除肝、脾、腎之外,幾乎所有正常臟器對(duì)該藥物的攝取能力均呈逐漸下降趨勢(shì),而腫瘤在12h時(shí)攝取能力達(dá)到最高水平,遠(yuǎn)高于其他正常臟器(3%vs0.07%~1.42%),而且在3h~24h間均維持在2.5%左右,提示該藥物可以在體內(nèi)與腫瘤特異結(jié)合并長(zhǎng)時(shí)間滯留在腫瘤局部。99mTc標(biāo)記的Rch24F(ab’)2抗體在體內(nèi)不僅具有腫瘤特異靶向分布的特征,還具有理想的T/NT比值,可清晰成像腫瘤。與小分子化合物或特異結(jié)合小肽顯像劑成像后圖像/背景信號(hào)比迅速衰減不同,它可以長(zhǎng)時(shí)間清晰成像腫瘤,這為進(jìn)一步加強(qiáng)診斷特異性、減少誤診率提供了新的判斷指標(biāo)。該小分子嵌合F(ab’)2抗體較以往所報(bào)道的全分子抗體顯像劑能以更快的速度達(dá)到體內(nèi)最佳靶向分布,3h時(shí)就可以開(kāi)始觀察,在5h~24h均能獲得清晰圖像,這不僅減少了99mTc放射藥物的放射劑量,而且增加其在臨床應(yīng)用中靈活性和方便性。因此,99mTc標(biāo)記的Rch24F(ab’)2抗體可能為未來(lái)臨床放射和醫(yī)學(xué)診斷結(jié)直腸癌提供一種新的、特異的、方