人肥胖抑制素放免法的建立及初步應用

人肥胖抑制素放免法的建立及初步應用

obstatin是一種由胃生長素基因編碼的生物活性多媒體算法。它由23個氨基酸組成，分子質(zhì)量為2546.9噸。其C末端的甘氨酸殘基帶有?；揎椈鶊F,可以拮抗胃生長素的食欲刺激作用,導致攝食減少、體重減輕。Obestatin最早是從大鼠胃組織中分離,大鼠、小鼠Obestatin的氨基酸序列完全一致,而嚙齒類動物與人Obestatin氨基酸序列的同源性達87%。腹腔或腦室內(nèi)注射Obestatin可抑制嚙齒類動物攝食、抑制其體重增加。還發(fā)現(xiàn)Obestatin能抑制口渴、干預胰島素分泌,并引起非快速動眼睡眠期顯著增加。由于Obestatin的生理功能廣泛,倍受研究者的關(guān)注。本文利用合成的人Obestatin(序列為Phe-Asn-Ala-Pro-Phe-Asp-Val-Gly-Ile-Lys-Leu-Ser-Gly-Val-Gln-Tyr-Gln-Gln-His-Ser-Gln-Ala-Leu-NH2),建立了高靈敏、高特異的人ObestatinRIA法,并應用于檢測冠心病、糖尿病患者和健康獻血員血清Obestatin水平,探討Obestatin在代謝紊亂疾病時的表達變化及可能的作用。材料和方法1藥物、試劑和儀器免疫用清潔級雄性新西蘭大耳白兔3只,體質(zhì)量1.25kg,由解放軍總醫(yī)院實驗動物中心提供(許可證編號D98010)。福氏完全及不完全佐劑購自Gibco/BRLue4f0公司;SephadexG-25葡聚糖凝膠、牛BSA購自Sigmaue4f0公司;Na125I購自Amershamue4f0公司;人Obestatin由杭州中肽ue4f0公司合成;健康獻血員和二組患者血清由本院生化科提供;免疫分離劑由北京北方ue4f0生物技術(shù)公司提供。SN-682型γ計數(shù)器購自上海日環(huán)ue4f0儀器一廠提供;HH6003型γ分析儀購自北京核海ue4f0高技術(shù)開發(fā)公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。2外周血血清學檢測2.1抗血清的制備將50μg人Obestatin與血藍蛋白連接后,以戊二醛法間隔1月免疫新西蘭白兔3次,首次免疫劑量加倍。末次免疫后一周于清醒狀態(tài)下分離白兔右側(cè)頸內(nèi)動脈并插管持續(xù)放血,收集血樣于4℃、3000×g離心15min,凍存于-80℃。2.2抗原的碘標記在0.5mL試管中依次加入Obestatin抗原3.0μg(5μL)、0.1mol/LpH7.4磷酸緩沖液(PB)15μL、Na125I5μL(18.5MBq)、氯胺-T10μg(10μL),振蕩30s后加入偏重亞硫酸鈉20μg(10μL)終止反應。將終止液緩慢加載于SephadexG-25凝膠柱上層,繼續(xù)以PB淋洗,收集第一個峰值計數(shù)的洗脫液,保存于4℃。2.3人外周血樣品的制備于平靜狀態(tài)下采集50名健康獻血員(平均年齡36.7±5.2歲,男女各半),50例冠心病患者(平均年齡45.9±4.6歲,男女各半)和50例糖尿病患者(平均年齡55.2±5.2歲,男女各半)的空腹靜脈血,血樣置37℃水浴20min后,于4℃、3000×g離心20min,保留上層血清于-20℃待測。2.4RIA法Obestatin標準點為30、100、300、900、2700、8100ng/L,測量時將200μL標準品或樣品與50μLObestatin抗血清、50μL125I-Obestatin(計數(shù)為20000cpm)充分混勻后,于4℃放置24h。加入免疫分離劑500μL室溫反應15min,4℃、3000×g離心20min,棄上清,測量沉淀的計數(shù)值并繪制標準曲線。加樣程序如表。2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法采用統(tǒng)計軟件Stata7.0進行數(shù)據(jù)處理。測量結(jié)果以xˉ±sxˉ±s表示,使用單因素方差分析(F檢驗)和t檢驗分別進行多樣本組間和兩樣本間比較,以P<0.05為有顯著性差異。結(jié)果1標準曲線的繪制Obestatin抗血清與125I-Obestatin的最高結(jié)合率約為37.0%~45.0%,非特異結(jié)合率為2.1%~2.6%,30~8100ng/LObestatin水平能獲得良好的標準曲線。依據(jù)該曲線即可獲得各血清Obestatin水平,如圖1。所用Obestatin抗血清的工作滴度為1∶4000,最終稀釋度為1∶24000。2方法學2.1敏感性和保密按B0±2s計算,最小可測值為30ng/L,樣品批內(nèi)及批間CV分別為5.4%和7.2%。2.2標準品和回收率該抗體與粒細胞集落刺激因子、表皮生長因子、TNF-α和IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-8和IL-10在250、500、1000、2000μg/L范圍內(nèi)均無交叉反應。在血清中加入高、中、低水平的Obestatin標準品后,回收率分別為104.0%、96.8%、91.0%,均值為97.3%。取Obestatin水平較高的血清樣品,作1/2~1/16倍比稀釋,測定結(jié)果和稀釋倍數(shù)之間有良好的線性關(guān)系。2.3冠心病和糖尿病組患者對比與健康獻血員組血清Obestatin水平相比,冠心病組和糖尿病組患者均顯著升高(P均<0.001)。兩組患者之間相比,冠心病組患者顯著高于糖尿病組患者(P<0.001),如圖2。血清ob10atin放免檢測指標Obestatin能引起大鼠攝食量和空腸收縮次數(shù)減少,體重增加速度變緩。Obestatin可與孤兒G蛋白受體GPR39結(jié)合,它和胃生長素由同一個基因編碼,分別經(jīng)過翻譯后不同片段的剪切和不同類型的修飾,對體重調(diào)節(jié)發(fā)揮相反的作用。鑒于Obestatin的多種功能,建立靈敏的檢測方法非常必要。本文在國內(nèi)首先建立了高效、靈敏、特異性強的人Obestatin放免法,獲得良好的實驗結(jié)果。125I-Obestatin、Obestatin標準品和Obestatin抗血清在凍干后于-20℃可保存較長時間,而且在保存期內(nèi)所做的標準曲線形態(tài)良好,批內(nèi)及批間CV、回收率和特異性等方法學指標均符合放免檢測的要求,適用于人血清Obestatin的測量。冠心病是由冠狀動脈狹窄、供血不足而引起的心肌功能障礙和/或器質(zhì)性病變,其中由冠狀動脈粥樣硬化引發(fā)的占95%~99%,而動脈粥樣硬化產(chǎn)生的主要原因是脂肪代謝異常。由于目前國內(nèi)外尚無報道Obestatin與冠心病之間的關(guān)聯(lián),本文結(jié)果表明冠心病組Obestatin水平顯著高于獻血員組的結(jié)果,提示Obestatin是一種靈敏的脂肪代謝異常指標。當機體出現(xiàn)脂肪代謝障礙、動脈粥樣硬化形成時,Obestatin可能作為一種反應性因子促進脂肪消耗、減少能量儲備。糖尿病是由于胰腺β細胞分泌胰島素功能障礙或胰島素受體對胰島素敏感性降低而造成的一種重要代謝紊亂疾病,患者通常出現(xiàn)高血糖的癥狀。最近,國外學者發(fā)現(xiàn)Obestatin能夠促進胰腺β細胞和胰島的存活,并誘導調(diào)控β細胞分泌功能的主要基因的表達,說明Obestatin對于提高胰島素分泌、降低高血糖具有重要作用。本文結(jié)果表明糖尿病組血清Obestatin水平顯著高于健康獻血員組,也說明當機體出現(xiàn)糖代謝異常時,能夠反饋上調(diào)Obestatin表達來促進胰島素分泌,從而抵抗高血糖造成的損害。本文結(jié)果還表明冠心病組血清Obestatin水平顯著高于糖尿病組,其原因目前國內(nèi)外尚無相關(guān)報道,本文考慮可能是由于Obestatin對脂肪代謝障礙的應答靈敏性高于對糖代謝異常的反應。總之,本文建立的人O