護(hù)肝片中柴胡皂苷的薄層鑒別

護(hù)肝片中柴胡皂苷的薄層鑒別

肝屏障是我國(guó)治療慢性肝炎的常用藥物之一，主要由柴胡、五味子、板藍(lán)根、恩贊、豬膽粉、綠茶等組成。在制備過(guò)程中，五味子含有五味子乙素，降低氨基酸丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的活力，增加肝細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)肝細(xì)胞的恢復(fù)和再生。柴胡疏肝解郁，保肝護(hù)膽，對(duì)抗肝炎病毒和肝臟脂肪性改變。豬膽粉具有清熱解毒、刺激膽汁分泌、增加腸道蠕動(dòng)和幫助。上述藥物組合,其功能為疏肝理氣,健脾消食。護(hù)肝片收載于《中華人民共和國(guó)藥典》2010年第一版一部中,標(biāo)準(zhǔn)中僅載入了五味子和豬去氧膽酸的鑒別方法,柴胡作為其中的有效成分,卻未提及。本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)選用薄層色譜法,篩選優(yōu)化柴胡的鑒別條件,為護(hù)肝片完善質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。1文獻(xiàn)總結(jié)1.1柴胡皂苷糖苷糖柴胡中所含的化學(xué)成分眾多,到目前為止,其中已分出約100余種皂苷成分。柴胡皂苷其苷元主要分為兩大類,即齊墩果烷型和熊果烷型,其糖部分常見有葡萄糖、鼠李糖、呋喃糖、木糖、戊糖醇等。其中,柴胡皂苷以柴胡皂苷a(d)、b2(b1)、c為主。1.2柴胡皂苷的分類柴胡皂苷結(jié)構(gòu)均為五環(huán)三萜類齊墩果烷型衍生物。皂苷由皂苷元和糖兩部分組成,其苷元分為7種不同類型:環(huán)氧醚、異環(huán)雙烯、12-烯、同環(huán)雙烯、12-烯-28-羧酸、異環(huán)雙烯-30-羧酸、18-烯型等。柴胡皂苷中一般含有葡萄糖、呋糖、鼠李糖、木糖和戊糖醇等。柴胡皂苷均為固體,無(wú)定形粉末或結(jié)晶。柴胡皂苷在甲醇、乙醇、含水正丁醇等極性大的有機(jī)溶劑有較大的溶解度,一般也能溶于水,屬于極性較大的物質(zhì)。苷元上連接的糖基增多,極性增強(qiáng),親水性增強(qiáng)(圖1、2)。2實(shí)驗(yàn)部分2.1機(jī)器、試劑和樣品2.1.1儀器、藥品和檢測(cè)方法主要儀器電子天平CPA225D(北京賽多利斯儀器公司)、水浴鍋(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)、電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、離心機(jī)-AnkeTDL80-2B(江蘇省響水縣醫(yī)療器械廠)、可裁剪型薄層層析板(天津斯利達(dá)色譜有限公司)、平頭微量進(jìn)樣器-10?L(上海光正醫(yī)療儀器有限公司)、Goodsee-I薄層色譜攝影儀(上海哲科生化技術(shù)有限公司)。此外還有層析缸、刻度吸管、研缽、250ml具塞錐形瓶、2ml容量瓶等。2.1.2樣品護(hù)肝片,見(表1)2.1.3試劑及試劑見表2-3。柴胡對(duì)照品a(中國(guó)生物制品檢定所)、柴胡對(duì)照品b2(中國(guó)生物制品檢定所)、甲醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、甲酸(36%)(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)、正丁醇(南京化學(xué)試劑有限公司)、氫氧化鈉(CP)(江蘇武進(jìn)縣化學(xué)試劑廠)、氨水(上海中試化工總公司)、濃硫酸(上海中試化工總公司)、無(wú)水乙醇(上海中試化工總公司)、石油醚(上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司)、對(duì)二甲氨基苯甲醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、三氯甲烷(上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司)2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1柴胡皂苷的提取柴胡皂苷在甲醇、乙醇、含水正丁醇等極性大的有機(jī)溶劑中有較大的溶解度,目前常用水飽和正丁醇溶液來(lái)提取柴胡皂苷。本品為中藥大復(fù)方制劑,成分復(fù)雜,含有多種揮發(fā)油。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以石油醚去除揮發(fā)油類及脂溶性成分,降低對(duì)皂苷成分的干擾。在用正丁醇提取柴胡皂苷時(shí),一些水溶性和酸性的雜質(zhì)亦同時(shí)被提取出來(lái),致使薄層色譜底色深,測(cè)定誤差較大。經(jīng)試驗(yàn),用水飽和的正丁醇多次萃取后,柴胡皂苷基本提取完全,所得正丁醇溶液用適量氫氧化鈉試液洗滌,除去水溶性和酸性雜質(zhì)。氫氧化鈉為強(qiáng)堿,點(diǎn)樣時(shí)易腐蝕硅膠,故又用氨試液洗滌除去殘留的氫氧化鈉溶液。2.2.2核心展開劑為0.2.3由于在三氯甲烷-甲醇-水(30:10:1)的展開劑中雜質(zhì)影響較大,拖尾現(xiàn)象較為嚴(yán)重,(見圖4(i))故采用石油醚的方法除去一部分脂溶性溶性雜質(zhì)。但雜質(zhì)的影響仍然存在。(見圖4(ii))氯仿-甲醇-水-甲酸(15︰5︰0.5︰0.2)(在原來(lái)展開劑的配比上加入0.2ml的甲酸,拖尾現(xiàn)象有些排除,雜質(zhì)影響減小,斑點(diǎn)分離情況改善,但分離度還不夠。見圖4(a))氯仿-甲醇-水-甲酸(15︰5︰0.5︰0.5)(在上述展開劑的基礎(chǔ)上增加甲酸的量,雜質(zhì)拖尾不明顯,但皂苷斑點(diǎn)的分離度變差。見圖4(b))氯仿-甲醇-水-甲酸(15︰8︰0.5︰0.5)(在上一個(gè)展開劑的基礎(chǔ)上,增加甲醇的量,主斑點(diǎn)的Rf值偏高,且和雜質(zhì)連成一條線。見圖4(c))氯仿-甲醇-水-甲酸(15︰4︰0.5︰0.5)(在n基礎(chǔ)上減少甲醇的量,雜質(zhì)和主斑點(diǎn)分離的很好,且主斑點(diǎn)之間的分離度也很好。見圖4(d))氯仿-甲醇-水-甲酸(9︰3︰0.2︰0.1)(柴胡干浸膏的斑點(diǎn)叫圓整,但略有拖尾,護(hù)肝片分離尚可,但也略有拖尾現(xiàn)象。見圖4(e))氯仿-甲醇-水-甲酸(9︰3︰0.2︰0.2)(上述基礎(chǔ)上增加甲酸的量,柴胡干浸膏和護(hù)肝片的斑點(diǎn)都較為圓整,分離度好,雜質(zhì)干擾較少。見圖4(f))2.2.3對(duì)照品溶液點(diǎn)樣實(shí)驗(yàn)表明,供試品溶液點(diǎn)樣5?L與對(duì)照品溶液點(diǎn)樣10?L較好。點(diǎn)樣量減少,低含量成分斑點(diǎn)不清晰,點(diǎn)樣量增加,柴胡皂苷斑點(diǎn)易擴(kuò)散。2.2.4對(duì)照藥材溶液的制備(1)供試品溶液的制備:取護(hù)肝片3片,研細(xì),溶解于3mL的石油醚中,提取片刻,離心,除去上清液,至水浴鍋中蒸干,殘?jiān)芙庥?mL的水中,后加2mL的正丁醇,振搖片刻后離心,取上清液,加入1mL的氫氧化鈉,反應(yīng)片刻后離心,取上清液,加入氨試液1mL,離心,取上清液,制得供試品。(2)柴胡對(duì)照藥材溶液的制備:柴胡皂苷尤其是柴胡皂苷a不夠穩(wěn)定,在制劑生產(chǎn)如煎煮過(guò)程中將發(fā)生明顯的降解破壞,并轉(zhuǎn)化為柴胡皂苷b,因而,柴胡制劑中的柴胡皂苷與柴胡對(duì)照藥材中的皂苷存在較大的差異。所以,柴胡對(duì)照藥材溶液不宜使用其直接醇提取液,而必須用護(hù)肝片相似的生產(chǎn)工藝進(jìn)行制備,讓柴胡皂苷在模擬生產(chǎn)過(guò)程中進(jìn)行適度的轉(zhuǎn)化后,再用與供試品溶液制備方法相同的方法制成對(duì)照藥材溶液,方能與供試品具有可比性,亦即對(duì)照性。故本方法按照制劑的方法取柴胡藥材粗粉適量,加水適量煎煮二次,每次1.5小時(shí),合并煎液,雙層紗布濾過(guò),濾液置蒸發(fā)皿中,水浴蒸發(fā)濃縮成清膏,轉(zhuǎn)移至已知重量的研缽中,80°C烘干,研細(xì),加糊精或蔗糖至適宜的重量(或濃度),即得柴胡干浸膏。柴胡對(duì)照藥材溶液的濃度參考《中國(guó)藥典2005版》“柴胡”項(xiàng)下對(duì)照藥材的溶液濃度來(lái)制備。取柴胡干浸膏適量(相當(dāng)于原藥材0.2g),按“供試品溶液的制備”的方法制備成每1mL含柴胡藥材0.2g的溶液。(3)展開劑的配制:用刻度吸管分別吸取氯仿9mL、甲醇3mL、甲酸0.2mL、水0.2mL,置于同一具塞錐形瓶中,振蕩使充分混勻,即得展開劑。(4)薄層層析:分別吸取表2-2中1-22的供試品溶液5?L、柴胡對(duì)照藥材溶液10?L,點(diǎn)于同一硅膠預(yù)制板上,放于預(yù)先平衡好的層析缸中,展開,展距為8.5cm,取出,揮干薄層板上的展開劑。浸入2%對(duì)甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液,取出薄層板,瀝干。置于烘箱中60°C烘5min,可見光和365nm下檢視。于掃描儀下掃描,圖片保存。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果護(hù)肝片中柴胡皂苷的快速鑒別結(jié)果(見圖5