鄰苯三酚反應(yīng)體系的制備及超氧陰離子自由基清除能力的研究

鄰苯三酚反應(yīng)體系的制備及超氧陰離子自由基清除能力的研究

采用鄰苯三酚自氧化的方法竹葉是“兩種藥物混合的天然植物”，通過提取物加以發(fā)育黃酮類健康養(yǎng)分。迄今為止,國內(nèi)外用于評價植物抗氧化能力的方法有硫氰酸鹽法、硫代巴比妥酸法、抗氧化能力指數(shù)法、化學(xué)發(fā)光法、清除自由基法等,這些方法各有利弊。鄰苯三酚自氧化的機(jī)理極為復(fù)雜,至今研究的還不是十分清楚。近年來,國內(nèi)外也有一些利用鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生超氧陰離子自由基法評價抗氧化能力的報道[9,10,11,12,13,14,15],但方法體系需進(jìn)一步系統(tǒng)的研究。本文對影響鄰苯三酚自氧化法的諸多因子進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,建立了一種完善的評價清除超氧陰離子自由基能力的方法,并用其評價了竹葉提取物的抗氧化能力。1材料和方法1.1化學(xué)試劑及試劑Ultrospec3300pro分光光度計,英國Biochrom公司;BP301S電子天平,德國Sartorius公司;MP3002電子天平,上海恒平科學(xué)儀器有限公司;鄰苯三酚(Pyrogallicacid),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;叔丁基對苯二酚(TBHQ),北京科華特種試劑朕合開發(fā)中心;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸(HCl)、乙醇、AB-8大孔樹脂等均為國產(chǎn)分析純試劑。1.2熱回流提取毛竹(Phyllostachysedulis)葉于2006年9月采自江蘇省南京林業(yè)大學(xué)竹種園。取6000g毛竹葉粉,95%乙醇,料液比1∶10,溫度60℃,熱回流提取4次,提取液過濾濃縮得浸膏;浸膏用盡量少95%乙醇溶解后上AB-8大孔樹脂柱,分別用純水,20%,40%,60%,80%乙醇、丙酮洗脫;水洗脫組分棄用,其他洗脫組分濃縮得干膏,備用。各洗脫組分簡稱如下:浸膏上大孔樹脂柱,水洗脫后,20%乙醇洗脫下組分(M20);20%乙醇洗脫后,40%乙醇洗脫下組分(M40);40%乙醇洗脫后,60%乙醇洗脫下組分(M60);60%乙醇洗脫后,80%乙醇洗脫下組分(M80);80%乙醇洗脫后,丙酮洗脫下組分(MA)。1.3溶液制備1.3.1液質(zhì)量濃度測定分別稱取合成抗氧化劑(TBHQ)和樣品,并用95%乙醇定容到100mL,得各樣品試液質(zhì)量濃度分別為:TBHQ:2.669mg·mL-1,M20:3.207mg·mL-1,M40:3.073mg·mL-1,M60:3.200mg·mL-1,M80:2.952mg·mL-1,MA:2.974mg·mL-1,待測。1.3.2ph值的調(diào)優(yōu)Tris溶液:稱取Tris12.11g,用水溶解定容至1000mL,得0.1mol·L-1Tris溶液。HCl溶液:量取36%～38%HCl4.29mL,用水溶解定容至1000mL,得0.05mol·L-1HCl溶液,將其稀釋5倍得10mmol·L-1HCl溶液。不同pH值Tris-HCl緩沖液:取5個250mL燒杯,分別加入50mL0.1mol·L-1Tris溶液和45mL0.05mol·L-1HCl溶液,混勻,用0.05mol·L-1HCl溶液調(diào)到pH值分別為7.4,7.8,8.2,8.6,9.0即可。鄰苯三酚溶液:稱取0.0378g鄰苯三酚,用10mmol·L-1HCl溶解定容至100mL,得3mmol·L-1鄰苯三酚溶液。2結(jié)果與分析2.1反應(yīng)體系的穩(wěn)定性測定鄰苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化反應(yīng),產(chǎn)生穩(wěn)定濃度的超氧陰離子自由基(O2·-)與中間物,中間物又與超氧陰離子自由基(O2·-)反應(yīng),得到一種帶有顏色的中間產(chǎn)物,此物在紫外有吸收,引起某一波長處吸光值的線性積累,來反應(yīng)抗氧化劑的清除能力的大小。量取pH值為8.2的Tris-HCl緩沖液5mL與4.7mL雙蒸水,置于10mL比色管中混均,在25℃水浴中保溫20min,取出后立即加入在25℃預(yù)熱過的3mmol·L-1鄰苯三酚0.3mL,迅速搖勻后倒入比色皿中,用10mmol·L-1HCl為空白液,在250～450nm波長處,分別在反應(yīng)1,3,6,9,17,25,33,39min后進(jìn)行8次掃描。從圖1可以看出:在1min時,反應(yīng)體系在最大吸收波長319.5nm處吸光值最低,并且隨反應(yīng)時間延長而增加,說明反應(yīng)體系產(chǎn)生有顏色中間產(chǎn)物積累越來越多;反應(yīng)體系最大吸收波長不隨反應(yīng)時間而變化,可以用319.5nm作為鄰苯三酚自氧化反應(yīng)體系的檢測波長,這與蔣柳云和樊志報道的319.9nm基本一致。2.2反應(yīng)時間t作線性關(guān)系用2.1配制方法配制鄰苯三酚反應(yīng)體系,在319.5nm處,每反應(yīng)1～3min(前期間隔1min,后期間隔3min)測一次吸光值,反應(yīng)40min,以吸光值A(chǔ)對反應(yīng)時間t作線性關(guān)系圖。從圖2(a)可以看出:反應(yīng)體系前期的吸光值隨反應(yīng)時間延長而穩(wěn)定增加,后期的吸光值趨于穩(wěn)定,在整個40min反應(yīng)時間內(nèi),吸光值和反應(yīng)時間線性關(guān)系較差;從圖2(b)可以看出:在前9min的反應(yīng)間內(nèi),反應(yīng)體系吸光值和反應(yīng)時間線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)達(dá)0.9942,說明反應(yīng)體系在前9min的反應(yīng)時間內(nèi),穩(wěn)定積累有顏色中間產(chǎn)物,鄰苯三酚自氧化速率穩(wěn)定,所以確定反應(yīng)時間為9min,取反應(yīng)前9min的吸光值A(chǔ)對反應(yīng)時間t作線性關(guān)系圖,以斜率為鄰苯三酚自氧化速率V0(0.035)。2.3清除超氧陰離子能力的測定—抗氧化劑清除超氧陰離子能力的評價方法量取pH值為8.2的Tris-HCl緩沖液5mL與一定體積的抗氧化劑溶液,用雙蒸水補(bǔ)充至9.7mL,置于10mL比色管中混均,在25℃水浴中保溫20min,取出后立即加入在25℃預(yù)熱過的3mmol·L-1鄰苯三酚0.3mL,迅速搖勻后倒入比色皿中,用10mmol·L-1HCl為空白液,在319.5nm波長處,每間隔1min測吸光值一次,共反應(yīng)9min,以吸光值A(chǔ)對反應(yīng)時間t作線性關(guān)系圖,斜率即為Vt,代入式(1),計算出抗氧化劑對超氧陰離子的清除率(Y)。根據(jù)加入抗氧化劑的體積和濃度,按定容至10mL,計算出抗氧化劑的反應(yīng)濃度c,由式(1)計算出c對應(yīng)的Y。由于反應(yīng)體系加入抗氧化劑的體積不同,得到不同的c和Y,以Y對c作線性關(guān)系圖,在Y為50%時的c值即為IC50值,IC50值越小說明抗氧化劑清除超氧陰離子能力越強(qiáng)。Y(%)(=1?VtV0)×100(1)Y(%)(=1-VtV0)×100(1)2.4清除y對tbhq反應(yīng)濃度c作線性關(guān)系在鄰苯三酚反應(yīng)體系中分別加入2.669mg·mL-1TBHQ溶液,0.1,0.2,0.25,0.3,0.4,0.5,0.8mL,按2.3方法計算,以清除率Y對TBHQ反應(yīng)濃度c作線性關(guān)系圖。由圖3可知,TBHQ對超氧陰離子的清除率與濃度呈很好的線性相關(guān),其IC50值為95.01mg·L-1。2.5tbhq添加量的確定在5個鄰苯三酚反應(yīng)體系中分別加入3mmol·L-1鄰苯三酚溶液0.1,0.2,0.3,0.4,0.5mL,再分別加入2.669mg·mL-1TBHQ0.35mL,按2.3節(jié)方法,計算出相應(yīng)的V0和Vt以及清除率Y。從表1可知,反應(yīng)體系1和2的V0和Vt都很低,且基本相等,清除率均為0.00,說明反應(yīng)體系產(chǎn)生有色氧化中間產(chǎn)物少,且加入TBHQ后沒有什么變化,說明加入鄰苯三酚的量少;反應(yīng)體系4和5的V0和Vt都相對較高,且基本相等,清除率分別為0.44、1.00,說明反應(yīng)體系產(chǎn)生有色氧化中間產(chǎn)物多,且加入TBHQ后沒有什么變化,說明加入鄰苯三酚是過量了,也可以說是加入TBHQ量太少;反應(yīng)體系3的清除率為34.25,反應(yīng)良好,加入0.3mL鄰苯三酚為宜。2.6tbhq反應(yīng)體系v0,vt和清除率測定在5個鄰苯三酚反應(yīng)體系中分別加入pH值為7.4,7.8,8.2,8.6,9.0的Tris-HCl緩沖溶液5mL,再分別加入2.669mg·mL-1TBHQ0.35mL,按2.3節(jié)方法,計算出相應(yīng)的V0,Vt和清除率。從表2可知,反應(yīng)體系1和2的V0和Vt都很低,且基本相等,清除率分別為0.00和2.96,說明反應(yīng)體系產(chǎn)生有色氧化中間產(chǎn)物少,且加入TBHQ后沒有什么變化,說明pH值為7.4和7.8的緩沖液不利產(chǎn)生有色中間產(chǎn)物;反應(yīng)體系4和5的V0和Vt出現(xiàn)負(fù)值現(xiàn)象,清除率分別是112.90和16.48,說明反應(yīng)體系氧化速率過快,吸光值很快達(dá)到最大值,然后降低,以致V0和Vt出現(xiàn)負(fù)值,無法進(jìn)行測定;反應(yīng)體系3的清除率為44.44,反應(yīng)體系反應(yīng)良好。所以,實驗取鄰苯三酚反應(yīng)體系中加入pH值為8.2的Tris-HCl緩沖液。2.7c50值的計算按2.3節(jié)方法,對竹葉提取物樣品進(jìn)行評價,其清除率Y對反應(yīng)濃度c作圖,得線性方程分別為:M20:Y=0.1604c-14.571,R2=0.9683;M40:Y=0.2466c-23.657,R2=0.9136;M60:Y=0.2082c-23.429,R2=0.9288;M80:Y=0.1893c-10.686,R2=0.9966;MA:Y=0.1121c-1.5296,R2=0.9288。計算出各樣品的IC50值分別為M20(402.56mg·L-1),M40(298.69mg·L-1),M60(352.68mg·L-1),M80(320.58mg·L-1),MA(459.68mg·L-1)。根據(jù)IC50值,各樣品清除超氧陰離子能力由強(qiáng)到弱依次為M40,M80,