人型前膠原含量測定的ria法及其在肝硬化診斷中的應(yīng)用

人型前膠原含量測定的ria法及其在肝硬化診斷中的應(yīng)用

1992年，作者從流行性出生的皮膚中提取并提取了i類原羥基（hpc），建立了血清hpc的ria法，并在臨床上推廣。但由于技術(shù)條件限制,受提取抗原活性及抗體效價、親和力的影響,操作繁瑣,時間長,不利于臨床使用。1996年作者改善了抗原的提取和抗血清的制備工藝,改進了hPCⅢRIA,現(xiàn)報道如下:材料和方法1高鹽廢水濃縮取4-6個月人流胎皮,制成勻漿。在4℃用內(nèi)含蛋白酶抑制劑的Tris-HClpH7.4緩沖液,提取48h。離心,上清液加硫酸氨鹽析。低溫高速離心,沉淀溶解后鹽析,超速離心。沉淀溶解透析除鹽、濃縮。采用中壓層析系統(tǒng),上DEAE-32纖維素柱層析除去酸性糖蛋白,再經(jīng)DEAE-52纖維素柱梯度洗脫,收集第二峰,并在1‰醋酸溶液中透析除鹽,濃縮即得hPCⅢ,于-85℃?zhèn)溆谩?蛋白質(zhì)標準品將hPCⅠ、hPCⅢ,牛PCⅢ、Ⅲ型膠原標準品,由Sigma公司提供;高分子量蛋白質(zhì)標準品,由Pharmacia公司提供。經(jīng)β巰基乙醇還原、用5%凝膠作SDS垂直平板電泳。3hpca免疫取300μghPCⅢ與等量完全福氏佐劑乳化后,于皮內(nèi)背部兩側(cè)多點注射免疫家兔。每隔兩周用200μghPCⅢ追加免疫,兩個月后耳靜脈取血,測抗血清效價。最后頸動脈放血,分離血清-85℃冷凍保存。412hpcndb的降解用改進氯胺T法將hPCⅢ標記125I。在尖底塑料管加入50μLpH7.5PBS和10μghPCⅢ、1.85×107BqNa125I,混勻后,加20μg氯胺T,反應(yīng)1.5min,加30μg半胱氨酸終止反應(yīng)。經(jīng)G-25柱,收集蛋白峰。測標記率及放化純度。5混合分離劑用工作緩沖液將hPCⅢ標準品配成0、40、80、160、320和640μg/L系列濃度。分離劑為二抗+6%PEG?？寡骞ぷ饕河?.1%BSA-2%NRS-0.05mol/LPBSpH7.4溶液配成1:50000。6前例不同性別組不同年齡性別肝功能分級情況肝炎與肝硬化按1995年全國傳染病寄生蟲會議修訂的診斷標準,原發(fā)性肝癌按中國常見惡性腫瘤診治規(guī)范中的標準。共測定384例血清hPCⅢ。急性肝炎組:33例,男20例,女13例,年齡15-60歲,均系黃疸型;慢活肝組:23例,男18例,女5例,年齡23-57歲;慢遷肝組:28例,男15例,女13例,年齡16-55歲;單純型肝癌組:42例,男34例,女8例,年齡15-67歲,其中29例有手術(shù)或病理診斷;肝硬化組:50例,男35例,女15例,年齡25-73歲,其中15例有手術(shù)或病理診斷;肝癌合并肝硬化組:63例,男48例,女15例,年齡21-78歲,其中46例有手術(shù)或病理診斷;膽石癥組:20例,男14例,女6例,年齡17-53歲,全部手術(shù)并取肝活檢;其它肝病組:25例,男15例,女10例,年齡15-72歲,包括肝血管瘤,脂肪肝等。正常參考組:100名,男55名,女45名,年齡18-47歲,為健康獻血員。7hpc-hpc法取100μL標準品(或待測樣品),200μL抗血清,100μL125I-hPCⅢ混勻后,4-8℃,放置4h。加入200μL分離劑,室溫放置30min,3500r/min離心20min,測沉淀計數(shù)率。結(jié)果1染色及分子量提純的hPCⅢ經(jīng)SDS電泳后,可見單一條區(qū)帶,經(jīng)β巰基乙醇還原后可見兩條區(qū)帶Proα1(Ⅲ)和Pα1(Ⅲ)。染色為膠原特有的粉紅色特征,與文獻報道一致。與原方法相比,電泳圖譜更清晰,說明抗原純度更高。hPCⅢ由3條Proα1(Ⅲ)組成,經(jīng)測定Proα1(Ⅲ)分子量為190kD,高于文獻報道動物Proα1(Ⅲ)的14.5-180kD。hPCⅢ約為570kD。2工作滴度3只兔免疫成功,經(jīng)瓊脂雙擴散法測定抗血清效價為1:128以上,經(jīng)RIA測定最終工作滴度分別為1:50000;1:45000和1:30000倍。與hPCⅠ的交叉反應(yīng)率為0.81%、與膠原CⅣ、CⅢ、CⅠ無交叉反應(yīng),見圖,過量抗體結(jié)合率大于80%。3125i-hpc標記結(jié)果125I-hPCⅢ的標記率為70%-80%,放化純度為98.5%±3.8%(n=10),比活度2.65×106Bq/μg。412標準曲線及血清hpc①標準抑制曲線見圖,競爭抑制關(guān)系良好,測定范圍為40-640μg/L。②靈敏度為6μg/L。③精確度:批內(nèi)CV為4.2%;批間CV為8.2%。④回收率為97.5%-106.3%,平均回收率為99.9%。⑤質(zhì)量控制:B0/T(%)為59.4%±4.0%(n=10),NSB為3.4%±0.7%(n=10),ED25為495.3±35.9μg/L(n=5);ED50為167.3±12.2μg/L(n=5);ED75為56.7±6.9μg/L(n=5);γ=0.999(n=5)。⑥健全性:將標本作5、10、20、40、90倍稀釋,稀釋倍數(shù)和測定結(jié)果呈線性關(guān)系。⑦血清hPCⅢ正常參考值為87.5±16.2μg/L,正常上限值為120μg/L(xˉ±2s)120μg/L(xˉ±2s)。⑧原法和改進法測定結(jié)果比較表明:兩種方法測同批質(zhì)控血清hPCⅢ水平無顯著性差異(P>0.05)。臨床標本的測定結(jié)果趨勢一致見表1。原方法與混合劑的聯(lián)合應(yīng)用人或動物的骨、皮膚中都富含膠原,其中以Ⅰ、Ⅲ膠原為主。提取的方法也各不相同,有從鼠皮和鼠骨中提取PCⅢ,也有從胎羊皮中提取PCⅢ的。因提取方法所采用工藝的不同,得到的PCⅢ純度和活性不一樣,從而影響制備的抗血清效價和親和力,建立的放免法也各不相同。1992年作者建立hPCⅢRIA非平衡法,由于提取方法簡陋,提取流程過長不易控制,致使抗原活性降低,影響抗血清的效價和親和力,延長了抗原和抗體反應(yīng)的時間,導(dǎo)致了建立的RIA方法煩瑣,穩(wěn)定性較差。本文采用了先進的抗原提取工藝和抗血清制備方法,抗原提純時用先進的中壓層析系統(tǒng),采用數(shù)字編程控制,縮短了純化周期和提高了每批層析結(jié)果的重現(xiàn)性。電泳結(jié)果顯示,與原方法相比,圖譜更清晰,抗原純度更高。在免疫動物時將酸溶性的hPCⅢ用醋酸鈉中和,提高了免疫動物的成活率和抗血清的效價及親和力。RIA測試結(jié)果表明,抗原純度與活性顯著提高,標記抗原的穩(wěn)定性和結(jié)合率得到較大改善,使抗原抗體的最大結(jié)合率由原來的25%提高到60%。免疫動物所得抗血清的效價也由1:3000提高到了1:50000。在此基礎(chǔ)上,將原來的非平衡法改進為平衡法,測試時間由原來的56h變?yōu)?h,大大縮短了測試時間和測試質(zhì)量