內(nèi)皮抑素的測定及其生物活性研究

內(nèi)皮抑素的測定及其生物活性研究

腫瘤的生長與血管生成依賴。原發(fā)腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移均需要新生血管,因而,腫瘤的抗血管生成治療是近年來腫瘤治療研究中的一個熱點。1997年,O′Reilly等在鼠內(nèi)皮瘤細胞培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)了一種新的、分子量為20kD的蛋白質(zhì)。體外實驗表明它能特異性地抑制內(nèi)皮細胞增生,并呈劑量依賴性,這一新的血管抑制因子被命名為內(nèi)皮抑素(Endostatin,ES)。ES優(yōu)良的生物活性,使之在腫瘤抗血管生成治療中展示了誘人的前景。本研究試圖建立131I標記ES的方法,為ES的臨床應用研究提供新的思路。1材料和方法1.1人瑤靜脈內(nèi)皮細胞系ES購自Sigma公司,131I由北京原子高科公司提供;Iodogen為Pierce公司產(chǎn)品。人臍靜脈內(nèi)皮細胞系(ECV304)購于上海細胞生物學研究所;MTT(四唑鹽)購自北京鼎國生物公司。1.2實驗方法1.2.1iofigen薄膜的制備①涂管:稱取0.5mgIodogen溶于0.25ml二氯甲烷內(nèi),分別取上述溶液30μl(約含50μgIodogen)分裝在各反應試管內(nèi),室溫自然干燥,使管底形成一層Iodogen薄膜,-20℃避光保存;②碘化標記:含有Iodogen膜的反應管內(nèi),加入0.3M磷酸鹽緩沖液,加入待標記ES樣品,再加入無載體131I,混勻,在室溫反應,并振蕩數(shù)次。加入pH7.4的0.3M磷酸鹽緩沖液終止反應,立即上柱純化;③Sephadex-G25柱凝膠過濾法分離純化:將全部反應液滴加于G25柱上,然后用同上磷酸鹽緩沖液淋洗(pH7.4),流速0.5ml/min,每分鐘收集1管,共20管,編號,測各管每分鐘計數(shù)(countsperminute,cpm),繪制洗脫曲線、計算標記率。1.2.2正交實驗結(jié)果將反應時間、ES用量、磷酸緩沖液用量、131I用量作為4個因素,對每個因素取3個水平進行正交實驗,選取L9(34)正交表,依次進行實驗,篩選出最佳標記條件。1.2.3展開劑為0紙層析法,支持體為新華Ⅰ號濾紙,展開劑為氯仿∶甲醇=7∶3,Rf值:131I-ES=0～3,游離131I=8～10,當展開劑到10cm時,晾干,用TLC-MINI-Scan進行掃描,Laura3.0軟件系統(tǒng)進行分析。1.2.4外部穩(wěn)定性試驗體外室溫放置后觀察產(chǎn)物的穩(wěn)定性。1.2.5tt法檢測細胞a值人臍靜脈內(nèi)皮細胞系(ECV304)經(jīng)培養(yǎng)至對數(shù)生長期,以5×103/孔將細胞接種于96孔培養(yǎng)板。37℃培養(yǎng)4h,以不同劑量的ES、131I及131I-ES處理細胞,并以同體積0.3mol/L磷酸緩沖液設為對照。繼續(xù)培養(yǎng)72h后,每孔加100μgMTT,孵育4h,棄上清,加150μl二甲基亞砜,振蕩10min,用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測450nm波長時的A值。處理組與對照組比較求得細胞存活率。2結(jié)果2.1標記的基礎結(jié)構用正交實驗進行篩選,共進行9次實驗,分別用紙層析法測得標記率,得到最佳標記條件的線索。選取標記率最高者與未標記ES分別進行柱層析,兩者A280(蛋白)分布圖與131I-ES放射性分布圖基本一致,說明核素成功地標記在ES上(圖1、2)。對標記條件進一步摸索,得到最佳標記條件為ES20μg,Iodogen50μg,131I18.5MBq,反應時間1min,標記率可達(65.0±5.5)%。2.2外部穩(wěn)定性室溫靜置5天后放化純下降了11%;圖3為不同時間后131I-ES中131I的解離曲線。2.3生物活性ES標記后,其抑制內(nèi)皮細胞增生的生物活性明顯強于單用ES或131I(圖4)。3es的陽性超微結(jié)構標記ES是1997年由O′Reilly等在鼠內(nèi)皮瘤細胞(一種非轉(zhuǎn)移性小鼠肝血管瘤細胞系EOMA)培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的一種新的分子量為20kD蛋白質(zhì)。體外實驗表明它能特異性地抑制內(nèi)皮細胞增生,并呈劑量依賴性,這一新的血管抑制因子被命名為內(nèi)皮抑素。內(nèi)皮抑素是膠原XVIIIC末端的一個分子量為20kD的片段,是一種內(nèi)源性腫瘤血管生成和內(nèi)皮細胞生長的抑制劑。這種膠原存在于細胞壁和基底膜上,在蛋白酶(如組織蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶)的作用下,它的蛋白C末端在酶作用下發(fā)生裂解而形成。ES抗血管生成的機制尚不清楚,但已有文獻報導,ES可與血管內(nèi)皮細胞上的硫酸粘蛋白類受體或血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的酪氨酸受體或整合素α2β1等競爭性結(jié)合,從而達到抑制新生血管的作用,這表明ES在血管內(nèi)皮細胞膜上可能存在特定的結(jié)合位點。由于實體瘤血管內(nèi)皮系統(tǒng)異常豐富,這形成了腫瘤陽性顯像的基礎。作者曾對血管抑素(Angiostitin)進行了99mTc的標記研究,發(fā)現(xiàn)在注藥后6h可得到腫瘤清晰顯像。ES是繼血管抑素后發(fā)現(xiàn)的又一內(nèi)源性血管生成抑制劑,本研究探索用131I標記ES,可為進一步研究ES在腫瘤顯像和治療方面的應用提供有力的工具。131I一直是內(nèi)放射治療的經(jīng)典放射性核素,以其合適的射線能量、半衰期,而且可同時進行顯像,幾十年應用不衰,而且不斷用于研制新的藥物,如標記一些單克隆抗體等,在生物導向治療中發(fā)揮作用。美國芝加哥大學的Hanna等人研究發(fā)現(xiàn),荷瘤小鼠體內(nèi)應用ES與外放射治療相結(jié)合,其療效明顯優(yōu)于單用ES或外放射治療。因此,作者設想用131I標記ES,一方面,ES通過抗血管生成作用達到對腫瘤的抑制,同時ES對腫瘤的相對趨向性可使131I定位于腫瘤而對腫瘤細胞直接產(chǎn)生殺傷作用,從而對腫瘤產(chǎn)生雙效治療作用。ES屬小分子量蛋白(20kD),其結(jié)構中含有131I標記時所必需的酪氨酸殘基。根據(jù)此結(jié)構特性,作者用傳統(tǒng)的Iodogen法對其進行標記。Iodogen法由于是固相氧化,反應體系中無過量氧化劑存在,