免疫球蛋白基因

第四章免疫球蛋白基因1編輯ppt免疫球蛋白是指具有與抗原決定簇特異性結(jié)合的許許多多球蛋白分子的總稱(chēng)。因?yàn)榭乖姆N類(lèi)極多，每種抗原上有不同的抗原決定簇，免疫球蛋白分子的種類(lèi)可以多達(dá)百萬(wàn)以上。人的基因組總數(shù)也不過(guò)l0萬(wàn)-20萬(wàn)。研究發(fā)現(xiàn)，不同免疫球蛋白的數(shù)量如此龐大是由于基因重排的結(jié)果。2編輯ppt

免疫球蛋白的基因庫(kù)1.H基因庫(kù)〔重鏈基因連鎖群〕第14號(hào)染色體2.κ基因庫(kù)〔κ鏈基因連鎖群〕第2號(hào)染色體3.λ基因庫(kù)〔λ鏈基因連鎖群〕第22號(hào)染色體3編輯ppt免疫球蛋白基因結(jié)構(gòu)輕鏈有兩種，即K鏈和λ鏈。胚系DNA的K鏈基因由Vk，Jk，和Ck三類(lèi)基因片段組成；每個(gè)v區(qū)基因上游都有一個(gè)L基因編碼的信號(hào)肽；J基因片段由5個(gè)基因組成，其中JK3是無(wú)效基因；J基因之間相距較近，J基因編碼的氨基酸也屬于V區(qū)肽段的一局部，稱(chēng)為連接片段；只有一個(gè)C基因，編碼K鏈C區(qū)肽段。K鏈基因結(jié)構(gòu)4編輯ppt胚系DNA的λ鏈由Vλ、

Jλ和Cλ三類(lèi)基因組成；

小鼠的λ鏈基因只有Vλl和Vλ2兩個(gè)V基因，兩個(gè)L基因即Ll，L2在V基因的上游；

J基因片段有4個(gè)基因，C基因片段也有4個(gè)基因，但其中Jλ4和Cλ4為無(wú)效基因，其余基因成簇排列；

Vλ基因編碼λ鏈的V區(qū)，J區(qū)基因編碼λ鏈的V區(qū)。Cλ基因編碼λ鏈全部C區(qū)。5編輯ppt重鏈基因結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，編碼可變區(qū)的基因片段除V，J和C基因片段外，還有D基因片段。

D片段位于VH和JH之間，編碼的氨基酸位于CDR3，與抗體的多樣性有關(guān)，故稱(chēng)D基因。6編輯pptVDJ-C

→IgM

VDJ-C3→→IgG3IgM→IgG3?IgM→其他類(lèi)別或亞類(lèi)Ig的現(xiàn)象,稱(chēng)為類(lèi)別轉(zhuǎn)換C基因的5’端一段重復(fù)性DNA序列,稱(chēng)為轉(zhuǎn)換區(qū)(switchregion)?僅C區(qū)轉(zhuǎn)換?抗原特異性不變5’C,C7編輯ppt免疫球蛋白基因的重排

輕鏈〔K〕基因重排免疫球蛋白基因，是在B細(xì)胞發(fā)育到小前B細(xì)胞時(shí)才開(kāi)始發(fā)生重排，使分布在胚系DKA上不同區(qū)域的V、J和C基因片段中的基因重排組合在一起，成為一個(gè)成熟的Ig基因，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄翻譯為成熟的輕鏈。K基因可以通過(guò)Vk區(qū)基因片段缺失、倒位的方式隨機(jī)與一個(gè)相隔一定距離的任何一個(gè)Jk基因片段相連接；重排后的VkJk片段再與Ck連接形成完整K鏈DNA，其中還有少數(shù)內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄后通過(guò)拼接除去；經(jīng)加工修飾，在RNA前體的5’和3’端分別加上帽結(jié)構(gòu)和PolyA尾，成為成熟的K鏈mRNA；mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，翻譯為K肽鏈。8編輯ppt9編輯ppt重鏈基因重排與表達(dá)重鏈基因是通過(guò)兩次重排形成的。第一次基因重排是D基因片段與JH基因片段的重排連接，得到DJH基因片段；第二次基因重排是VH基因片段與DJH片段重排和連接，得到VHDJH的連接片段；經(jīng)過(guò)兩次重排的DNA仍有一內(nèi)含子，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄以后得到初轉(zhuǎn)錄的RNA，再修飾成為成熟的H鏈mRNA，翻譯出H鏈蛋白。10編輯ppt11編輯ppt體細(xì)胞基因突變V區(qū)基因在重排后仍可發(fā)生改變、這種改變是由體細(xì)胞突變產(chǎn)生的。體細(xì)胞突變只改變VJ或VDJ單個(gè)片段的個(gè)別核苷酸，也會(huì)導(dǎo)致免疫球蛋白的特異性變化。體細(xì)胞突變只發(fā)生在IgG和IgA，而不發(fā)生在IgM，因此這種突變可能與免疫球蛋白的種類(lèi)轉(zhuǎn)換有關(guān)。B細(xì)胞發(fā)生體細(xì)胞突變的頻率很高，平均每次細(xì)胞分裂，每對(duì)堿基發(fā)生突變的概率為10-3，比其他基因的自發(fā)突變頻率高106倍。12編輯ppt免疫球蛋白的合成與分泌初次應(yīng)答初次應(yīng)答的特點(diǎn)是抗原第一次免疫后血清中抗體濃度緩慢地增加，從誘發(fā)免疫到抗體產(chǎn)生有一個(gè)較長(zhǎng)的遲滯期。抗體產(chǎn)生的量較少，效價(jià)低?？贵w以IgM為主并最早出現(xiàn)。IgG也有，但出現(xiàn)較IgM為遲。初次應(yīng)答的頂峰期大約在免疫后10d左右。初次應(yīng)答答除了產(chǎn)生特異的漿細(xì)胞分泌抗體之外，還有一些受到刺激的幼B細(xì)胞發(fā)育到一定程度不再分化而保持體止?fàn)顟B(tài)，這就是記憶B細(xì)胞。記憶B細(xì)胞不分泌抗體，只有在受到特異性抗原刺激后才能激活而成為分泌抗體的漿細(xì)胞。記憶B細(xì)胞是長(zhǎng)命B細(xì)胞，可以存活數(shù)月甚至機(jī)體終身存活。13編輯ppt免疫應(yīng)答過(guò)程中抗體產(chǎn)生規(guī)律14編輯ppt再應(yīng)答當(dāng)用與初應(yīng)答相同抗原再次或?qū)掖蚊庖咄粍?dòng)物產(chǎn)生的免疫應(yīng)答即為再應(yīng)答。再應(yīng)答與初次應(yīng)答不同的是：①應(yīng)答反響的速度快，記憶B細(xì)胞受到特異性抗原刺激后立即開(kāi)始反響；⑦產(chǎn)生的抗體以IgG為主，IgM很少，此外還出現(xiàn)IgA、IgE；③產(chǎn)生抗體的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)初次應(yīng)答，抗體具高親和力。15編輯ppt16編輯pptTd和Ti抗原的免疫應(yīng)答蛋白質(zhì)抗原在T細(xì)胞缺乏時(shí)不誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，故稱(chēng)為胸腺依賴(lài)抗原〔Td抗原〕。Td抗原激活B細(xì)胞，除必須有抗原作為第一信號(hào)外，還需Th細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子作為第二信號(hào)。一些非蛋白抗原如多糖、脂類(lèi)、核酸等誘導(dǎo)的抗體反響無(wú)需Th細(xì)胞，因此也稱(chēng)非依賴(lài)性抗原(Ti)。Ti抗原能誘導(dǎo)初次免疫應(yīng)答，而無(wú)記憶細(xì)胞產(chǎn)生，因而也無(wú)重鏈轉(zhuǎn)換和親和力成熟的再次免疫應(yīng)答。17編輯ppt抗體形成中抗體種類(lèi)的轉(zhuǎn)換機(jī)制

抗體免疫應(yīng)答中首先出現(xiàn)IgM同種型，然后出現(xiàn)1gG；特別在再應(yīng)答中有許多類(lèi)型的同種型出現(xiàn)。控制抗體類(lèi)別轉(zhuǎn)換的核酸序列稱(chēng)為轉(zhuǎn)換區(qū)?；罨蟮腂細(xì)胞DNA上每一類(lèi)C區(qū)基因的上游都有一個(gè)個(gè)轉(zhuǎn)換區(qū)。

Cμ的轉(zhuǎn)換區(qū)Sμ的結(jié)構(gòu)是由[(GAGCT)nGGCGT]m重復(fù)序列組成的，n=1~7，以n＝3最常見(jiàn)，m可多達(dá)150。轉(zhuǎn)換區(qū)的長(zhǎng)短次序?yàn)镾γl>Sγ2b>Sμ＞Sγ3＞Sγ2a.18編輯ppt具有免疫球蛋白種類(lèi)特異性的重組酶分別與這些轉(zhuǎn)換區(qū)的序列結(jié)合成為基因重排中產(chǎn)生那種免疫球蛋白同種型及其亞型轉(zhuǎn)換的重要環(huán)節(jié)。有報(bào)道說(shuō)明轉(zhuǎn)換信號(hào)來(lái)自Th細(xì)胞合成的細(xì)胞介素，如細(xì)胞介素IL-4。在轉(zhuǎn)換中會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)換區(qū)的重組，如轉(zhuǎn)換區(qū)Sμ與Sγl通過(guò)缺失連接重組，重組的轉(zhuǎn)換區(qū)DNA經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄和剪接，除去Sμ的3’端與Sγl的5’端之間的一段DNA序列．使VDJ那么能與Cγl最緊密地連接為VDJCγl的mRNA，最后表達(dá)IgGl免疫球蛋白。19編輯ppt20編輯ppt21編輯ppt影響體液免疫應(yīng)答的因素不同種類(lèi)的抗原和不同的免疫途徑導(dǎo)致免疫應(yīng)答的方式與特點(diǎn)的變化。不同種類(lèi)細(xì)胞因子或其相比照例不同對(duì)B細(xì)胞的作用也不一樣。Th1細(xì)胞主要誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和遲發(fā)型變態(tài)反響；Th2細(xì)胞刺激IgE和IgG1(小鼠)或IgG4(人)抗體形成。刺激B細(xì)胞的增殖的細(xì)胞因子有多種，如來(lái)源于T細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-2、IL-4和IL-5。22編輯ppt免疫球蛋白mRNA與其他蛋白基因的表達(dá)方式類(lèi)似，免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA前體需經(jīng)過(guò)修飾才形成有功能的mRNA。在免疫球蛋白R(shí)NA前體近3’端有一保守的多聚腺苷酸化信號(hào)〔AAUAAA〕，poly(A)多聚酶識(shí)別此信號(hào)序列，在其下游15~30核苷酸處切開(kāi)，并加上約250個(gè)腺苷酸形成poly(A)尾，同時(shí)在5端形成帽結(jié)構(gòu)。加帽和接尾完成后，RNA前體經(jīng)過(guò)RNA剪接除去內(nèi)含子并將外顯子連接起來(lái)。mRNA一旦形成，即從核中轉(zhuǎn)出，與胞質(zhì)中的核糖體結(jié)合。23編輯ppt膜結(jié)合型和分泌型免疫球蛋白的表達(dá)抗體的存在形式：膜型(membraneimmunoglobulin,mIg)—膜外表免疫球蛋白，B細(xì)胞膜上的抗原受體；分泌型(secretedimmunoglobulin,sIg)—分泌進(jìn)入體液,介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。24編輯ppt如CH基因片段由Cμl，Cμ2，Cμ3和Cμ4四個(gè)外顯子分別編碼；在Cμ4外顯子的下游約1.8kb處還有兩個(gè)外顯子M1和M2分別編碼跨膜局部和胞內(nèi)局部；在RNA前體中有兩個(gè)poly(A)信號(hào)位點(diǎn)，位點(diǎn)1位于Cμ4的3’端，而位點(diǎn)2在M2外顯子的3’端；如果剪切相加尾發(fā)生在位點(diǎn)1，那么形成分泌型的mRNA；如果剪切和加尾發(fā)生在位點(diǎn)2，那么Cμ4的3’端的親水序列除去并與M1外顯子拼接，形成膜結(jié)合型mRNA。25編輯ppt26編輯pptB細(xì)胞發(fā)育與抗體形成B細(xì)胞來(lái)源于骨髓的干細(xì)胞，早期的B細(xì)胞并不分泌免疫球蛋白；形成抗體分泌B細(xì)胞〔漿細(xì)胞〕需經(jīng)過(guò)兩個(gè)發(fā)育階段：即非抗原依賴(lài)階段和抗原依賴(lài)階段前一階段主要發(fā)生在骨髓，后一階段發(fā)生在外周循環(huán)中。27編輯ppt從原始造血細(xì)胞分化發(fā)育為成熟的B細(xì)胞，需經(jīng)過(guò)原B細(xì)胞，前B細(xì)胞，幼B細(xì)胞(包括小幼B細(xì)胞和幼B細(xì)胞)等中間發(fā)育階段。在成熟B細(xì)胞階段表達(dá)膜抗體即抗原受體mIgM和mIgD，并從骨髓遷至外周淋巴器官脾和淋巴結(jié)，在這里接受抗原的刺激，發(fā)育為抗體分泌的漿細(xì)胞和記憶B細(xì)胞。28編輯ppt29編輯ppt抗體在細(xì)胞內(nèi)的裝配，運(yùn)轉(zhuǎn)與分泌抗體是在細(xì)胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上由不同的多聚核糖體參與分別翻譯成L鏈和H鏈的。L鏈和H鏈在多聚核糖體上開(kāi)始聚合裝配。裝配的Ig分子轉(zhuǎn)入糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；脫下先導(dǎo)序列，進(jìn)入平面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，直到高爾基體；在高爾基體內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程中繼續(xù)完成鏈的裝配及糖的修飾，通過(guò)“出芽〞的方式形成許多允滿抗體的小泡；小泡移動(dòng)到胞膜，并與胞膜融合使抗體釋放到細(xì)胞外。30編輯ppt31編輯ppt在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，3~4個(gè)月的胎兒淋巴細(xì)胞已經(jīng)到達(dá)了成人的水平；但胎兒主要形成B細(xì)胞外表上膜結(jié)合抗體；出生以后隨年齡的增加依次形成IgM，IgG，IgA。大約到7歲IgG才能到達(dá)成年水平。32編輯ppt33編輯ppt出生時(shí)嬰兒的抗體IgG都來(lái)自母體，出生后迅速下降，到第7個(gè)月完全消失。同時(shí)嬰兒自身形成的抗體是隨漿細(xì)胞成熟的水平逐步增加。34編輯ppt35編輯ppt免疫血清的制備1.免疫動(dòng)物選擇2.免疫方法3.動(dòng)物采血法4.免疫血清的別離及保存36編輯ppt

一、免疫動(dòng)物選擇

能作免疫接種用的動(dòng)物主要是哺乳類(lèi)和禽類(lèi)。兔、綿羊、豚鼠、雞、山羊和馬。

一、免疫動(dòng)物選擇

1.抗原與免疫動(dòng)物種屬差異越遠(yuǎn)越好；2.動(dòng)物必須適齡、健壯、無(wú)感染的正常動(dòng)物、體重符合要求；

3.不同動(dòng)物種類(lèi)對(duì)同一免疫原有不同的免疫應(yīng)答；

4.按需要量選擇大小不同的動(dòng)物。37編輯ppt

二、免疫方法3.免疫方案①全量免疫法：弗氏佐劑抗原屢次注射②微量免疫法：卡介苗7天弗氏佐劑1月抗原③混合免疫法：綜合皮下、淋巴結(jié)和靜脈二、免疫方法

1.免疫原的注射劑量2.免疫途徑：免疫反響產(chǎn)生速度依次為靜脈＞腹腔＞肌肉＞皮下＞皮內(nèi)＞淋巴結(jié)＞足掌38編輯ppt

三、動(dòng)物采血法1.頸動(dòng)脈放血法：最常用的方法2.心臟采血法：要求操作熟練3.靜脈采血法：1.4℃保存：可保存3～6個(gè)月2.低溫保存：-20～-40℃，可保存2～3年3.冰凍枯燥保存：可保存3～5年三、動(dòng)物采血法四、免疫血清的分離和保存39編輯ppt抗體的純化和鑒定1.抗體特異性的純化2.特異性IgG類(lèi)抗體的純化3.特異性抗體的鑒定40編輯ppt

一、抗體特異性的純化

1.親合層析法：將交叉抗原交聯(lián)到Sepharose4B上，裝柱后，將預(yù)吸收的抗體通過(guò)親合層析柱，雜抗體吸附在柱上，流出液那么是特異性抗體。一、抗體特異性的純化2.吸附法：利用不含特異性抗原的抗原液，直接加到免疫血清中，抗原那么與抗體結(jié)合，上清液那么為無(wú)雜抗體的單價(jià)特異性抗體。41編輯ppt1.鹽吸沉淀法：經(jīng)硫酸銨鹽析提取γ球蛋白3次，根本為IgG類(lèi)抗體，但不純。二、特異性IgG類(lèi)抗體的純化2.A蛋白親和層析：SPA與IgG的Fc段有很強(qiáng)的特異性的親和力，細(xì)菌外表不同位點(diǎn)獨(dú)立地與抗體結(jié)合，一個(gè)A蛋白至少可以結(jié)合二個(gè)IgG分子。適合純化細(xì)胞培養(yǎng)上清中的McAb。3.其它：凝膠過(guò)濾、離子交換層析等42編輯ppt

三、特異性抗體的鑒定

1.抗體效價(jià)的鑒定：即為抗體活性滴定三、特異性抗體的鑒定

2.抗體特異性鑒定：

①細(xì)菌類(lèi)抗原的抗體用凝集試驗(yàn)

②可溶性抗原的抗體用雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

3.抗體的純度鑒定：免疫電泳分析法

43編輯ppt

1.周?chē)?個(gè)孔放不同稀釋度的相應(yīng)Ab。

2.以出現(xiàn)沉淀線的血清最高稀釋倍數(shù)為該抗體的效價(jià)。

3.可進(jìn)行任意稀釋。

抗體效價(jià)滴定44編輯ppt原理凝集試驗(yàn)抗原溶液與相應(yīng)抗體溶液混合，在電解質(zhì)存在下，抗原與抗體結(jié)合出現(xiàn)可見(jiàn)的絮狀沉淀。操作步驟方法評(píng)價(jià)：

敏感度較低、簡(jiǎn)便、易受抗原抗體比例影響臨床意義：測(cè)定抗原抗體反響的最適比。45編輯ppt1:21:41:81:161:321:641:128各管抗原倍比稀釋參加抗血清各管抗體量不變振搖混勻、37℃孵育沉淀量不同出現(xiàn)沉淀量最多的管為最適比例管。輕搖絮狀沉淀試驗(yàn)絮狀沉示意圖淀AgAbAg46編輯ppt原理

二、雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)將可溶性抗原和抗體置于瓊脂凝膠板的對(duì)應(yīng)孔中，兩者各自在凝膠中向四周自由擴(kuò)散，當(dāng)抗原與抗體相遇，在比例適宜時(shí)形成沉淀線。操作步驟

應(yīng)用：1.檢測(cè)未知Ag或Ab2.Ag性質(zhì)分析3.Ab效價(jià)滴定4.Ag或Ab純度鑒定47編輯ppt雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)原理示意圖AbAg模擬圖染色標(biāo)本圖1.抗原抗體雙向自由擴(kuò)散2.24小時(shí)出結(jié)果3.呈現(xiàn)沉淀線或弧48編輯ppt抗原抗體反響的特點(diǎn)*1.特異性*2.比例性*3.可逆性

49編輯ppt一、特異性〔specificity〕*概念：抗原分子，只能與由它刺激所產(chǎn)生的抗體結(jié)合而起反響的專(zhuān)一性能。一、特異性*決定因素：由抗原決定簇和抗體分子超變區(qū)之間空間結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性決定的。

抗體分子N端可變區(qū)形