基于二茂鐵的便攜式血糖儀的研制

基于二茂鐵的便攜式血糖儀的研制

1醫(yī)院血糖檢測(cè)所使用的檢測(cè)方法糖尿病是由胰島素分泌不足或生物效應(yīng)降低引起的代謝疾病，嚴(yán)重危害人類健康。目前還沒(méi)有徹底根治糖尿病的醫(yī)學(xué)方法,積極地預(yù)防治療和早期篩查是有效的控制手段。體外檢測(cè)血糖值,是患者安全有效的監(jiān)測(cè)方式,有助于糖尿病患者的康復(fù)治療。目前醫(yī)院常用方法是采集患者靜脈血,分離血清后加入化學(xué)試劑或酶試劑,用大型生化儀進(jìn)行檢測(cè)。此方法雖然準(zhǔn)確,但檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、需血量多(2ml)、需專業(yè)人員操作,不利于患者自我監(jiān)護(hù)。上世紀(jì)80年代以來(lái),相繼出現(xiàn)了各種便攜式血糖儀,大多使用葡萄糖傳感器電極檢測(cè),操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短,利于門診、家庭自我檢測(cè)。國(guó)內(nèi)使用的酶電極型血糖儀大多依賴進(jìn)口,國(guó)產(chǎn)的只有幾臺(tái),大多數(shù)研究單位仍以手工制作酶電極為主。血糖測(cè)試條即酶電極大規(guī)模批量生產(chǎn)工藝是障礙血糖測(cè)試系統(tǒng)成功研發(fā)的關(guān)鍵。二茂鐵即二環(huán)戊二烯基鐵(C5H5-Fe-C5H5),化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,耐高溫達(dá)400℃,并耐紫外光,抗燒堿溶液或鹽酸的分解。二茂鐵、鐵氰化鉀等可在較低的工作電壓下(03V),直接將電子從酶活反應(yīng)中心傳遞到電子表面。本文介紹一種由二茂鐵為電子媒介體的酶電極法血糖儀的研制。2葡萄糖氧化酶檢測(cè)本儀器的主要部件是測(cè)量微電流的生物傳感器,由絕緣基片、參考電極、工作電極,與工作電極相連的葡萄糖氧化酶反應(yīng)區(qū)及連接參考電極和反應(yīng)區(qū)的導(dǎo)電介質(zhì)等組成。只需很小體積的血液,將血糖測(cè)試條接觸被測(cè)血液時(shí),測(cè)試條定量吸取1.5μl的血液,被測(cè)血液通過(guò)毛細(xì)虹吸擴(kuò)散到葡萄糖氧化酶反應(yīng)區(qū),血樣中的葡萄糖與葡萄糖氧化酶接觸。葡萄糖與葡萄糖氧化酶反應(yīng)產(chǎn)生葡萄糖酸和過(guò)氧化氫,同時(shí)產(chǎn)生電子,電子被導(dǎo)電介質(zhì)二茂鐵捕獲,隨著電化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行直至反應(yīng)終止,在2個(gè)電極之間產(chǎn)生一個(gè)電勢(shì),通過(guò)電極與導(dǎo)電介質(zhì)鐵氰化鉀的氧化反應(yīng)產(chǎn)生電流,且電流強(qiáng)度與被測(cè)葡萄糖濃度成正比。血糖儀測(cè)量到電流后,由模數(shù)轉(zhuǎn)換器將模擬量的電信號(hào)轉(zhuǎn)換為數(shù)據(jù)信號(hào),傳送給單片計(jì)算機(jī),進(jìn)而對(duì)讀取的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、轉(zhuǎn)換,換算成血糖含量數(shù)據(jù),送至液晶顯示器,顯示出血糖含量,整個(gè)過(guò)程約20s。3電極材料測(cè)試條的制作在電極表面固定葡萄糖氧化酶是生物傳感器關(guān)鍵的環(huán)節(jié),本研究的血糖儀采用碳糊法固定酶的方法,以電子媒介體二茂鐵提高葡萄糖傳感器的靈敏度和線性范圍。制備過(guò)程如下:(1)在1g石墨粉中加入12%纖維素和適當(dāng)?shù)亩F,混勻。將適當(dāng)數(shù)目的尼龍質(zhì)網(wǎng)材綁在250mm×250mm的方型輕質(zhì)金屬方框上,在暗室內(nèi)涂上感光膠,干燥。(2)將計(jì)算機(jī)繪制的電極模型膠片置于感光膠片上,紫外曝光15min。用水槍沖洗,干燥后成絲印膜板。(3)將絲印膜板安裝于自動(dòng)絲印機(jī)上,調(diào)整間距和壓力后,加上導(dǎo)電漿料制成基電極,將銀漿、碳漿涂布在基電極上,于60℃～100℃下烘烤30～90min。將生物元件噴涂液(葡萄糖氧化酶活性在250U/mg以上,適量鐵氰化鉀,磷酸緩沖液)加入噴涂?jī)x器的儲(chǔ)存器中,設(shè)置間距和液滴大小,直接噴涂到厚膜電極的工作區(qū)上,制成電極式血糖測(cè)試條。(4)測(cè)試條在30%的相對(duì)濕度下、室溫干燥4～8h,用剪切機(jī)切成35mm×5mm大小。4溫度補(bǔ)償檢測(cè)在電路設(shè)計(jì)中,要給檢測(cè)所用的酶電極兩端加上03V的電壓,這個(gè)電壓要保持恒定,不能隨葡萄糖的濃度變化而變化。血液在酶電極上產(chǎn)生的微電流非常小不便于測(cè)量,所以將其先轉(zhuǎn)化成電壓信號(hào),然后再進(jìn)行放大。一些來(lái)自電源和系統(tǒng)噪聲的干擾信號(hào)通過(guò)濾波除去,使測(cè)試更加精確。經(jīng)過(guò)處理后的電壓通過(guò)A/D轉(zhuǎn)換后輸入單片機(jī),單片機(jī)經(jīng)過(guò)計(jì)算得出血糖的濃度值,再利用液晶顯示將結(jié)果顯示出來(lái)。(mmol/L、mg/dl濃度相互切換顯示,100mg/dl=556mmol/L)。溫度是影響酶催化反應(yīng)的一個(gè)重要因素,酶的活性也與溫度有直接的關(guān)系,溫度升高時(shí),酶催化反應(yīng)速度增加,但高溫會(huì)使酶蛋白變性而失活。在20℃～50℃范圍內(nèi)考慮了葡萄糖響應(yīng)值與溫度的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)在這一溫度范圍內(nèi),傳感器均能體現(xiàn)良好的檢測(cè)性能,同時(shí)考慮電極的靈敏度和使用壽命,血糖儀制作時(shí)另外配置溫度補(bǔ)償系統(tǒng)。血糖儀呈橢圓形,其外形按照人體工程學(xué)設(shè)計(jì),體積943mm×49.2mm×17.8mm,重量50g,在掌中感到特別舒服,十分輕巧便攜。5測(cè)試電極材料利用二茂鐵為電子媒介體的酶電極型血糖儀,感應(yīng)快、精度高。其測(cè)試條(酶電極)在使用前始終處于干燥狀態(tài),便于保存,性能穩(wěn)定。本血糖儀在性能上主要有以下幾個(gè)特點(diǎn):5.1采血測(cè)試數(shù)據(jù)本儀器的所有功能都由單鍵控制完成,用戶只需按鍵開機(jī),插上測(cè)試條,用特制的采血筆從指尖采血,測(cè)試條自動(dòng)吸入1.5μl血樣,待測(cè)試條上的血樣足夠后,只需20s,就可顯示血糖數(shù)據(jù)。而其他血糖儀一般需要更長(zhǎng)時(shí)間才能完成這個(gè)過(guò)程。5.2與本血糖儀比較采用經(jīng)典的葡萄糖氧化酶技術(shù)與先進(jìn)的電流感應(yīng)法相結(jié)合來(lái)測(cè)試血糖,測(cè)試結(jié)果已經(jīng)校正為血漿血糖值,可與醫(yī)院化驗(yàn)室的測(cè)試結(jié)果進(jìn)行直接比較。美國(guó)YSI(金泉儀器公司)生產(chǎn)的YSI2300StatPlus葡萄糖分析儀,該葡萄糖分析儀通過(guò)FDA認(rèn)證,是理想的仲裁工具,檢測(cè)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn),與本血糖儀的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行臨床前的性能比較,結(jié)果能達(dá)到臨床要求。以美國(guó)FDA的標(biāo)準(zhǔn),便攜式血糖檢測(cè)儀測(cè)試條的血糖檢測(cè)結(jié)果與大型生化檢測(cè)儀的結(jié)果相比,誤差在20%以內(nèi)都認(rèn)為結(jié)果準(zhǔn)確日。5.2.1儀器精密度試驗(yàn)用糖酵解的全血標(biāo)本,加入不同量的β-D-葡萄糖混合完全,制得葡萄糖含量不同的血樣品。設(shè)置5個(gè)葡萄糖濃度水平:低濃度(0～50mg/dl)、正常濃度(50～100mg/dl)、稍高濃度(100～150mg/dl)、中高濃度(150～300mg/dl)和高濃度(300～500mg/dl),檢測(cè)儀器的精密度,結(jié)果如表1所示。在葡萄糖含量為正常濃度、稍高濃度、中高濃度和高濃度時(shí),血糖儀檢測(cè)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差CV為3.0%～4.3%,小于5.0%;在葡萄糖含量為低濃度時(shí),血糖儀檢測(cè)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.8%,小于8.0%。在不同葡萄糖濃度情況下,血糖儀的檢測(cè)結(jié)果的精度為±1mg/dl,與YSI2300StatPlus葡萄糖分析儀的檢測(cè)結(jié)果相比,CV小于10%,其結(jié)果是準(zhǔn)確的。5.2.2檢測(cè)結(jié)果比較通過(guò)血糖儀檢測(cè)結(jié)果與YSI2300StatPlus葡萄糖分析儀檢測(cè)結(jié)果對(duì)照,可以評(píng)估系統(tǒng)的臨床準(zhǔn)確性。在室溫下,抽出志愿者的毛細(xì)血標(biāo)本測(cè)量血糖值,進(jìn)行比較。用誤差圖格分析2種儀器的檢測(cè)結(jié)果,如圖1所示。誤差圖格分析法是國(guó)外公認(rèn)的評(píng)價(jià)血糖儀準(zhǔn)確性的方法,與相關(guān)分析的區(qū)別在于增加血糖儀臨床應(yīng)用價(jià)值分析。如圖1所示,使用血糖儀檢測(cè)結(jié)果絕大多數(shù)落在A區(qū),個(gè)別結(jié)果落在B區(qū),表明使用血糖儀對(duì)毛細(xì)全血的檢測(cè)結(jié)果與使用YSI2300StatPlus葡萄糖分析儀的檢測(cè)結(jié)果符合得很好,臨床準(zhǔn)確度高。5.2.3果線性回歸分析血糖儀與YSI葡萄糖分析儀測(cè)試結(jié)果線性回歸分析如圖2所示。在50～500mg/dl內(nèi),顯示出很高的正線性相關(guān),兩者檢測(cè)結(jié)果符合得很好。6實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)分析我們研究的生物酶電極屬于一種葡萄糖生物傳感器,在有機(jī)絕緣材料做成的電極基片上,將導(dǎo)電材料用噴涂法印制形成工作電極和對(duì)電極的基體,它們的中間部分表面上涂覆一層聚碳酸酯絕緣體,在工作電極基體下端部分涂覆一層二茂鐵和擴(kuò)散限制膜技術(shù)形成的反應(yīng)層,形成生物酶電極。二茂鐵化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,在電子傳遞中表現(xiàn)出優(yōu)越的性能。實(shí)驗(yàn)證明,引入了新的電子媒介體后,從整體上提高了生物傳感器的各項(xiàng)性能和實(shí)用性。在實(shí)驗(yàn)樣本血糖濃度范圍內(nèi),此范圍也覆蓋了低、中、高血糖濃度的監(jiān)測(cè)范圍,線性關(guān)系成立,故儀器測(cè)量范圍定為50～500mg/dl(正常人體空腹血糖值為70～109mg/dl)。中國(guó)現(xiàn)有5000多萬(wàn)人受到糖尿病的威脅,糖尿病將是未來(lái)我國(guó)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。與傳統(tǒng)的血糖儀相比,二茂鐵介導(dǎo)的酶電極血糖儀的研制表現(xiàn)出了許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn):小型便攜,分析速度快(20s),所需樣品量少(15μl),患者疼痛感明顯降低,污染大大減少(采用1次性