第四章酶與酶工程

生物工程與技術(shù)導(dǎo)論第四章酶與酶工程知識(shí)網(wǎng)絡(luò)4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶與酶工程發(fā)展簡(jiǎn)史時(shí)間人物發(fā)現(xiàn)4000多年前的夏禹時(shí)代釀酒技術(shù)3000多年前的周朝制造飴糖、食醬等食品2500多年前的春秋戰(zhàn)國(guó)麴治療消化不良等疾病19世紀(jì)30年代開(kāi)始人們才真正認(rèn)識(shí)酶的存在和作用1833年佩恩（Payen）帕索茲（Persoz）乙醇沉淀麥芽的水抽提物得到可使淀粉水解生成可溶性糖的物質(zhì)，稱(chēng)之為淀粉酶（diastase）19世紀(jì)中葉巴斯德（Pasteur）大量研究酵母的乙醇發(fā)酵，認(rèn)為在活酵母細(xì)胞內(nèi)有一種可以將糖發(fā)酵生成乙醇的物質(zhì)1878年昆尼（Kunne）首次將酵母中進(jìn)行乙醇發(fā)酵的物質(zhì)稱(chēng)為酶，該詞來(lái)自希臘文，意思

“在酵母中”1896年巴克納（Buchner）兄弟酵母無(wú)細(xì)胞抽提液也能將糖發(fā)酵成乙醇，表明酶不僅在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞外也可以一定條件下進(jìn)行催化作用促進(jìn)了酶的分離以及對(duì)其理化性質(zhì)的研究，一般認(rèn)為酶學(xué)研究始于此4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶與酶工程發(fā)展簡(jiǎn)史時(shí)間人物發(fā)現(xiàn)1902年亨利（Henri）根據(jù)蔗糖酶催化蔗糖水解的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提出中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)，認(rèn)為底物在轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物之前，必須首先與酶形成中間復(fù)合物，然后再轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，并重新釋放出游離的酶1913年米徹利斯（Michaelis）曼吞（Menton）根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)，推導(dǎo)出酶催化反應(yīng)的基本動(dòng)力學(xué)方程—米氏方程。米氏方程的提出，是酶反應(yīng)機(jī)理研究領(lǐng)域的一個(gè)重要突破1926年薩姆納（Sumner）首次從刀豆提取液中分離純化得到脲酶結(jié)晶，并證明它具有蛋白質(zhì)的性質(zhì)后來(lái)對(duì)一系列酶的研究，都證實(shí)酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)。在此后的50多年中，

“酶是具有生物催化功能的蛋白質(zhì)”這一概念被普遍接受。4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶與酶工程發(fā)展簡(jiǎn)史時(shí)間人物發(fā)現(xiàn)1960年雅各（Jacob）莫諾德（Monod）提出操縱子學(xué)說(shuō)，闡明了酶生物合成的基本調(diào)節(jié)機(jī)制1982年切克（Cech）四膜蟲(chóng)細(xì)胞的26SrRNA前體具有自我剪接功能。認(rèn)為RNA亦具有催化活性，并將具有催化活性的RNA稱(chēng)為核酸類(lèi)酶1983年阿爾特曼（Altman）核糖核酸酶PRNA部分M1RNA具有核糖核酸酶P的催化活性，而該酶的蛋白質(zhì)部分C5蛋白卻沒(méi)有酶活性RNA具有生物催化活性這一發(fā)現(xiàn)，改變了有關(guān)酶的概念。為此Cech和Altman共同獲得1989年度的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。研究表明，核酸類(lèi)酶具有完整的空間結(jié)構(gòu)和活性中心，有獨(dú)特的催化機(jī)制，具有很高的底物專(zhuān)一性，其反應(yīng)動(dòng)力學(xué)亦符合米氏方程的規(guī)律。引出“酶是具有生物催化功能的生物大分子（蛋白質(zhì)或RNA）”的新概念。4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的分類(lèi)與命名蛋白質(zhì)酶（P酶）的分類(lèi)與命名國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)（InternationalCommissionofEnzymes）：成立于1956年，受?chē)?guó)際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)（InternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology）以及國(guó)際理論與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（InternationalUnionofPureandAppliedChemistry）領(lǐng)導(dǎo)。該委員會(huì)一成立，第一件事就是著手研究當(dāng)時(shí)混亂的酶的名稱(chēng)問(wèn)題。對(duì)于蛋白類(lèi)酶的分類(lèi)和命名做了大量的工作。當(dāng)時(shí)，酶的命名沒(méi)有普遍遵循的準(zhǔn)則，不可避免地產(chǎn)生混亂。確立酶的分類(lèi)和命名原則，在當(dāng)時(shí)是急需解決的問(wèn)題。4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的分類(lèi)與命名蛋白質(zhì)酶（P酶）的分類(lèi)與命名⑴有時(shí)相同的一種酶有兩個(gè)或多個(gè)不同的名稱(chēng)例：催化淀粉水解生成糊精的酶，就有液化型淀粉酶、糊精淀粉酶、α-淀粉酶等多個(gè)名字。⑵有時(shí)一個(gè)名稱(chēng)卻用以表示兩種或多種不同的酶例：琥珀酸氧化酶名字，曾用于琥珀酸脫氫酶、琥珀酸半醛脫氫酶、NAD(P)+琥珀酸半醛脫氫酶等多種不同的酶。⑶有些酶的名稱(chēng)則令人費(fèi)解

例：觸酶、黃酶、間酶等。⑷有些酶的名稱(chēng)與發(fā)現(xiàn)者有關(guān)例：高峰淀粉酶來(lái)自日本學(xué)者高峰讓吉的姓氏，他于1894年首次從米曲霉中制備得到一種淀粉酶制劑，用作消化劑。4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的分類(lèi)與命名蛋白質(zhì)酶（P酶）的分類(lèi)與命名根據(jù)國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)的建議，每一種具體的酶都有其推薦名和系統(tǒng)命名。推薦名是在慣用名稱(chēng)的基礎(chǔ)上，加以選擇和修改而成。酶的推薦名一般由兩部分組成:底物名稱(chēng)+催化反應(yīng)的類(lèi)型。后面加

“酶”字（-ase）。正反應(yīng)還是逆反應(yīng)，都用同一個(gè)名稱(chēng)。例：葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase），表明該酶的作用底物是葡萄糖，催化的反應(yīng)類(lèi)型屬于氧化反應(yīng)。

對(duì)于水解酶類(lèi)，催化水解反應(yīng)，命名時(shí)可以省去說(shuō)明反應(yīng)類(lèi)型的“水解”字樣，只在底物名稱(chēng)之后加上“酶”字即可，如淀粉酶、蛋白酶、乙酰膽堿酶等。有時(shí)還可以再加上酶的來(lái)源或其特性，如木瓜蛋白酶、酸性磷酸酶等。4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的分類(lèi)與命名蛋白質(zhì)酶（P酶）的分類(lèi)與命名系統(tǒng)命名更詳細(xì)、更準(zhǔn)確地反映出該酶所催化的反應(yīng)。系統(tǒng)名稱(chēng)（systematicname）包括了酶的作用底物、酶作用的基團(tuán)及催化反應(yīng)的類(lèi)型。例：葡萄糖氧化酶的系統(tǒng)命名為“β-D-葡萄糖：氧1-氧化還原酶”（β-D-glucose:oxygen1-oxidoreductase）。表明該酶所催化的反應(yīng)以β-D-葡萄糖為脫氫的供體，氧為氫受體，催化作用在第一個(gè)碳原子基團(tuán)上進(jìn)行，所催化的反應(yīng)屬于氧化還原反應(yīng)。4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的分類(lèi)與命名蛋白質(zhì)酶（P酶）的分類(lèi)與命名蛋白類(lèi)酶（P酶）的分類(lèi)原則為：⑴按照酶催化作用的類(lèi)型，將蛋白類(lèi)酶分為6大類(lèi)。第1大類(lèi)，氧化還原酶第2大類(lèi)，轉(zhuǎn)移酶第3大類(lèi)，水解酶第4大類(lèi)，裂合酶第5大類(lèi)，異構(gòu)酶第6大類(lèi)，合成酶（或稱(chēng)連接酶）⑵每個(gè)大類(lèi)中，按照酶作用的底物、化學(xué)鍵或基團(tuán)的不同，分為若干亞類(lèi)。⑶每一亞類(lèi)中再分為若干小類(lèi)。⑷每一小類(lèi)中包含若干個(gè)具體的酶。4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的分類(lèi)與命名蛋白質(zhì)酶（P酶）的分類(lèi)與命名根據(jù)系統(tǒng)命名法，每一種具體的酶，除了有一個(gè)系統(tǒng)名稱(chēng)以外，還有一個(gè)系統(tǒng)編號(hào)。系統(tǒng)編號(hào)采用四碼編號(hào)方法。第一個(gè)號(hào)碼表示該酶屬于6大類(lèi)酶中的某一大類(lèi)第二個(gè)號(hào)碼表示該酶屬于該大類(lèi)中的某一亞類(lèi)第三個(gè)號(hào)碼表示屬于亞類(lèi)中的某一小類(lèi)第四個(gè)號(hào)碼表示這一具體的酶在該小類(lèi)中的序號(hào)

每個(gè)號(hào)碼之間用圓點(diǎn)（.）分開(kāi)。4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的分類(lèi)與命名蛋白質(zhì)酶（P酶）的分類(lèi)與命名例：葡萄糖氧化酶的系統(tǒng)編號(hào)為[EC1.1.3.4]。EC1.1.3.4表示國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)EnzymeCommission表示第1大類(lèi)，即氧化還原酶表示第1亞類(lèi)，被氧化基團(tuán)是CH-OH基團(tuán)表示第3小類(lèi)，氧為氫受體表示在小類(lèi)中的特定序號(hào)4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的分類(lèi)與命名核酸類(lèi)酶（R酶）的分類(lèi)與命名對(duì)于核酸類(lèi)酶的分類(lèi)和命名沒(méi)有統(tǒng)一的原則和規(guī)定。R酶采用下列分類(lèi)原則：⑴根據(jù)酶作用底物是其本身RNA分子還是其他分子，將核酸類(lèi)酶分為兩大類(lèi)：分子內(nèi)催化R酶和分子間催化R酶。⑵在每個(gè)大類(lèi)中，根據(jù)酶的催化類(lèi)型不同，將R酶分為若干亞類(lèi)，如剪切酶、剪接酶和多功能酶等。⑶在每個(gè)亞類(lèi)中，根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和催化特性的不同，分為若干小類(lèi)。⑷在每個(gè)小類(lèi)中，包括若干個(gè)具體的R酶。⑸在可能與蛋白類(lèi)酶（P酶）混淆的情況下，標(biāo)明R酶，以示區(qū)別。4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的分類(lèi)與命名核酸類(lèi)酶（R酶）的分類(lèi)與命名由于蛋白類(lèi)酶和核酸類(lèi)酶的組成和結(jié)構(gòu)不同，命名和分類(lèi)原則有所區(qū)別。為了便于區(qū)分兩大類(lèi)別的酶，有時(shí)催化的反應(yīng)相似，命名卻有所不同。例：催化大分子水解生成較小分子的酶，核酸類(lèi)酶中屬于剪切酶，蛋白類(lèi)酶中屬于水解酶；核酸類(lèi)酶中的剪接酶可以催化剪切與連接反應(yīng)，蛋白類(lèi)酶中的轉(zhuǎn)移酶亦催化相似的反應(yīng)，可以從一個(gè)分子中將某個(gè)基團(tuán)剪切下來(lái)，連接到另一個(gè)分子中去。4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的結(jié)構(gòu)與作用特點(diǎn)酶的結(jié)構(gòu)絕大多數(shù)酶的本質(zhì)是蛋白，根據(jù)酶的組成成分，分為單純酶和結(jié)合酶兩類(lèi)。單純酶的結(jié)構(gòu)組成中除蛋白外無(wú)其他成分，酶的活性決定于蛋白部分。結(jié)合酶的分子組成中除蛋白成分外，還有一些對(duì)熱穩(wěn)定的非蛋白小分子物質(zhì)，其分子組成中的蛋白部分稱(chēng)酶蛋白，非蛋白小分子物質(zhì)稱(chēng)輔助因子。酶蛋白與輔助因子結(jié)合形成的復(fù)合物稱(chēng)全酶，通常只有全酶才能起催化作用。在催化反應(yīng)中，酶蛋白與輔助因子所起的作用不同，酶反應(yīng)的專(zhuān)一性及高效性取決于酶蛋白，而輔助因子則起電子、原子或某些化學(xué)基團(tuán)的傳遞作用。4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的結(jié)構(gòu)與作用特點(diǎn)酶的結(jié)構(gòu)直接與底物結(jié)合并和酶催化作用直接有關(guān)的區(qū)域叫酶的活性中心（activecenter）或活性部位（activesite）。酶的活性中心有兩個(gè)功能部位：⑴結(jié)合部位：一定的底物靠此部位結(jié)合到酶分子上。⑵催化部位：底物的鍵在此處被打斷或形成新的鍵，從而發(fā)生一定的化學(xué)變化。圖4-1酶的活性中心4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的結(jié)構(gòu)與作用特點(diǎn)酶的結(jié)構(gòu)參與構(gòu)成酶活性中心和維持酶特定構(gòu)象所必需的基團(tuán)稱(chēng)為酶的必需基團(tuán)。酶的必需基團(tuán)包括兩大類(lèi)：1）活性中心內(nèi)的必需基團(tuán)：活性中心內(nèi)的一些化學(xué)基團(tuán)，是酶發(fā)揮催化作用與底物直接作用的有效基團(tuán)。2）活性中心外的必需基團(tuán)：在活性中心外的區(qū)域，還有一些不與底物直接作用的必需基團(tuán)，這些基團(tuán)與維持整個(gè)酶分子的空間構(gòu)象有關(guān)，可使活性中心的各個(gè)有關(guān)基團(tuán)保持于最適的空間位置，間接對(duì)酶的催化活性發(fā)揮其必不可少的作用。4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的結(jié)構(gòu)與作用特點(diǎn)作用特點(diǎn)⑴專(zhuān)一性酶的專(zhuān)一性是指在一定的條件下，一種酶只能催化一種或一類(lèi)結(jié)構(gòu)相似的底物進(jìn)行某種類(lèi)型反應(yīng)的特性。酶的專(zhuān)一性絕對(duì)專(zhuān)一性相對(duì)專(zhuān)一性4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的結(jié)構(gòu)與作用特點(diǎn)作用特點(diǎn)①絕對(duì)專(zhuān)一性：一種酶只能催化一種底物進(jìn)行一種反應(yīng)，這種高度的專(zhuān)一性稱(chēng)為絕對(duì)專(zhuān)一性。例：乳酸脫氫酶[EC1.1.1.27]催化丙酮酸進(jìn)行加氫反應(yīng)生成L－乳酸。4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的結(jié)構(gòu)與作用特點(diǎn)作用特點(diǎn)核酸類(lèi)酶也同樣具有絕對(duì)專(zhuān)一性：

四膜蟲(chóng)26SrRNA前體等催化自我剪接反應(yīng)的R酶，只能催化其本身RNA分子進(jìn)行反應(yīng)，而對(duì)于其它分子一概不作用。圖4-2四膜蟲(chóng)26SrRNA前體4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的結(jié)構(gòu)與作用特點(diǎn)作用特點(diǎn)②相對(duì)專(zhuān)一性：一種酶能夠催化一類(lèi)結(jié)構(gòu)相似的底物進(jìn)行某種相同類(lèi)型的反應(yīng)，這種專(zhuān)一性稱(chēng)為相對(duì)專(zhuān)一性。相對(duì)專(zhuān)一性又可分為鍵專(zhuān)一性和基團(tuán)專(zhuān)一性。例：酯酶可催化所有含酯鍵的酯類(lèi)物質(zhì)水解生成醇和酸。鍵專(zhuān)一性的酶能夠作用于具有相同化學(xué)鍵的一類(lèi)底物。4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的結(jié)構(gòu)與作用特點(diǎn)作用特點(diǎn)基團(tuán)專(zhuān)一性的酶則要求底物含有某一相同的基團(tuán)。例：核酸類(lèi)酶M1RNA，催化tRNA前體5’-末端的成熟。要求底物核糖核酸的3’-端部分是一個(gè)tRNA，而對(duì)其5’-端部分的核苷酸鏈的順序和長(zhǎng)度沒(méi)有要求，催化反應(yīng)的產(chǎn)物為一個(gè)成熟的tRNA分子和一個(gè)低聚核苷酸。

例：胰蛋白酶[EC3.4.31.4]選擇性地水解含有賴(lài)氨酰-或精氨酰-的羰基的肽鍵。圖4-3胰蛋白酶選擇性水解4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的結(jié)構(gòu)與作用特點(diǎn)作用特點(diǎn)⑵高效性酶催化的轉(zhuǎn)換數(shù)（每個(gè)酶分子每分鐘催化底物轉(zhuǎn)化的分子數(shù)）一般為103min-1左右。酶催化和非酶催化反應(yīng)所需的活化能有顯著差別，如圖所示，酶催化反應(yīng)比非酶催化反應(yīng)所需的活化能要低得多。圖4-4酶與非酶催化所需的活化能4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的結(jié)構(gòu)與作用特點(diǎn)作用特點(diǎn)⑶條件溫和酶的催化作用一般都在常溫、常壓、pH近乎中性的條件下進(jìn)行。一是由于酶催化作用所需的活化能較低；二是由于酶是具有生物催化功能的生物大分子。在高溫、高壓、在過(guò)高或過(guò)低pH等極端條件下，大多數(shù)酶會(huì)變性失活而失去其催化功能。圖4-5酶的溫和催化條件4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的結(jié)構(gòu)與作用特點(diǎn)作用特點(diǎn)⑷可調(diào)節(jié)性①共價(jià)修飾調(diào)節(jié)：在其他酶的催化作用下，某些酶蛋白肽鏈上的一些基團(tuán)可與某種化學(xué)基團(tuán)發(fā)生可逆的共價(jià)結(jié)合，從而改變酶活性，此過(guò)程稱(chēng)為共價(jià)修飾。常見(jiàn)調(diào)節(jié)類(lèi)型主要有：磷酸化與脫磷酸化，乙?；兔撘阴；谆兔摷谆?，腺苷化和脫腺苷化等。圖4-6磷酸化與脫磷酸化的共價(jià)修飾調(diào)節(jié)4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的結(jié)構(gòu)與作用特點(diǎn)作用特點(diǎn)②變構(gòu)調(diào)節(jié)：具有變構(gòu)調(diào)節(jié)作用的酶稱(chēng)為變構(gòu)酶，一般是寡聚酶，由多亞基組成，包括催化部位和調(diào)節(jié)（別構(gòu)）部位。使酶分子變構(gòu)并使其催化活性發(fā)生改變的物質(zhì)稱(chēng)為效應(yīng)物或變構(gòu)劑。根據(jù)配體性質(zhì)分為同促效應(yīng)和異促效應(yīng)；根據(jù)配體結(jié)合后對(duì)后繼配體的影響分為正協(xié)同效應(yīng)和負(fù)協(xié)同效應(yīng)。4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的結(jié)構(gòu)與作用特點(diǎn)作用特點(diǎn)變構(gòu)酶的動(dòng)力學(xué)曲線：V對(duì)[S]作圖不服從米-曼氏（Michaelis-Menten）關(guān)系式，不呈直角雙曲線，而是S形曲線（正協(xié)同）或表觀雙曲線（負(fù)協(xié)同）。圖4-7變構(gòu)酶的動(dòng)力學(xué)特征4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的結(jié)構(gòu)與作用特點(diǎn)作用特點(diǎn)③同工酶調(diào)節(jié)：在同一種屬中，催化活性相同而酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及免疫學(xué)性質(zhì)不同的一組酶稱(chēng)為同工酶（isoenzyme）。同工酶在體內(nèi)的生理意義主要在于適應(yīng)不同組織或不同細(xì)胞器在代謝上的不同需要。例：乳酸脫氫酶酶（LDH）為2種亞基構(gòu)成的四聚體，在體內(nèi)有5種分子形式即LDH1（H4），LDH2（H3M），LDH3（H2M2），LDH4（HM3）和LDH5（M4）。圖4-8乳酸脫氫酶酶的五種同工酶4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的結(jié)構(gòu)與作用特點(diǎn)作用特點(diǎn)圖4-9胃蛋白酶的酶原激活調(diào)節(jié)④酶原激活調(diào)節(jié)：有些酶在細(xì)胞內(nèi)合成或初分泌時(shí)只是酶的無(wú)活性前體，此前體物質(zhì)稱(chēng)為酶原。在一定條件下，酶原向有活性酶轉(zhuǎn)化的過(guò)程叫酶原的激活，例如胃蛋白酶的酶原激活調(diào)節(jié)。除了這四種常見(jiàn)的調(diào)節(jié)方式外，酶活性調(diào)節(jié)還有一些其它的調(diào)節(jié)方式。例：限制性蛋白水解作用、抑制劑與激活劑的調(diào)節(jié)等（略）。4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的作用機(jī)制專(zhuān)一性機(jī)制⑴三點(diǎn)附著學(xué)說(shuō)（three-pointattachmenttheory）：認(rèn)為酶與底物的結(jié)合處至少有三個(gè)點(diǎn)，而且只有一種情況是完全結(jié)合的形式。只有這種情況下，不對(duì)稱(chēng)催化作用才能實(shí)現(xiàn)。圖4-10酶與底物“三點(diǎn)附著”示意圖4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的作用機(jī)制專(zhuān)一性機(jī)制⑵鎖鑰學(xué)說(shuō)（LockandkeyHypothesis）：1894年Fischer提出。認(rèn)為整個(gè)酶分子的天然構(gòu)象是具有剛性結(jié)構(gòu)的，酶表面具有特定的形狀，酶與底物的結(jié)合如同一把鑰匙對(duì)一把鎖一樣，即底物分子進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的部位與酶分子活性中心具有緊密互補(bǔ)的關(guān)系。圖4-11酶與底物“鎖鑰”結(jié)構(gòu)示意圖4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的作用機(jī)制專(zhuān)一性機(jī)制⑶誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō)（InducedfitHypothesis）：1958年Koshland提出。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為酶表面并沒(méi)有一種與底物互補(bǔ)的固定形狀，而只是由于底物的誘導(dǎo)才形成了互補(bǔ)形狀，從而有利于底物的結(jié)合。圖4-11酶與底物“誘導(dǎo)契合”示意圖4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的作用機(jī)制高效能機(jī)制從熱力學(xué)角度來(lái)看，酶催化的高效性主要是由于酶能降低反應(yīng)的活化能（但不會(huì)改變反應(yīng)平衡點(diǎn)）。綜合來(lái)說(shuō)，與降低反應(yīng)活化能相關(guān)及酶催化效率相關(guān)的因素主要有如下幾個(gè)方面：⑴廣義的酸堿催化廣義上的酸堿催化是指酶活性部位上的某些基團(tuán)可以作為質(zhì)子供體或質(zhì)子受體對(duì)底物進(jìn)行酸或堿催化。能供給質(zhì)子的物質(zhì)即為酸，能接受質(zhì)子的物質(zhì)即為堿，如下式所示：HA=A-+H+HA為酸，A-為堿HA（酸）+A=AXH（酸催化）AXH+B-（堿）=Y+BH+A-（堿催化）4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的作用機(jī)制高效能機(jī)制⑵共價(jià)催化某些酶在催化反應(yīng)時(shí)，本身能放出或吸取電子并作用于底物的缺電子或負(fù)電子中心，并與底物以共價(jià)方式形成中間物。這種中間物可以很快轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨艽鬄榻档偷霓D(zhuǎn)變態(tài)，從而提高催化反應(yīng)速度。按酶對(duì)底物所攻擊的基團(tuán)的不同，該催化方式又分為親核催化（nucleophiliccatalysis）和親電子催化（cetecrophiliccatalysis）。親電試劑具有強(qiáng)烈親和電子的原子中心，而親核試劑具有強(qiáng)烈供給電子的原子中心。4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的作用機(jī)制高效能機(jī)制⑶鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)鄰近效應(yīng)指雙分子反應(yīng)的兩個(gè)底物分子相鄰近時(shí)，提高了底物的有效濃度。而底物分子在活性中心的“定向”排布，有利于原子軌道的重疊—軌道定向，使分子間反應(yīng)近似于分子內(nèi)反應(yīng)。圖4-12鄰近效應(yīng)和定向效應(yīng)示意圖4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶的作用機(jī)制高效能機(jī)制⑷變形或張力酶使底物分子中的敏感鍵發(fā)生變形或張力，從而使底物的敏感鍵更易于破裂。⑸表面效應(yīng)酶的活性中心為酶分子的凹穴，此處多為非極性或疏水性的氨基酸殘基的疏水區(qū)域。底物與酶的反應(yīng)常在酶分子的內(nèi)部疏水環(huán)境中進(jìn)行，疏水環(huán)境排斥了介于底物與酶分子之間的水膜，從而消除了水分子對(duì)酶和底物功能基團(tuán)的干擾，有利于底物與酶分子間的直接接觸?？傊?，一種酶的催化反應(yīng)常常是多種催化機(jī)制的綜合作用，這是酶促反應(yīng)提高效率的原因。4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是研究酶促反應(yīng)速度及其影響因素的科學(xué)。酶的催化作用主要受到底物濃度、酶濃度、溫度、pH值、激活劑濃度、抑制劑濃度等諸多因素的影響。米氏方程：V為反應(yīng)速度，S為底物濃度，Vm為最大反應(yīng)速度，Km為米氏常數(shù)，為酶催化反應(yīng)速度等于最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度。4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)底物濃度是決定酶催化反應(yīng)速度的主要因素。V圖4-13底物濃度與酶催化反應(yīng)速度的關(guān)系底物濃度較低時(shí)，酶催化反應(yīng)速度與底物濃度成正比，反應(yīng)速度隨著底物濃度的增加而加快。當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定值時(shí)，反應(yīng)速度的上升不再與底物濃度成正比，而是逐步趨向平衡。酶催化反應(yīng)的基本動(dòng)力學(xué)方程闡明了底物濃度與酶催化反應(yīng)速度之間的定量關(guān)系。有些酶在底物濃度過(guò)高時(shí)，反應(yīng)速度反而下降，這主要是由于高濃度底物引起的抑制作用。（一）底物濃度的影響4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)在底物濃度足夠高的條件下，酶催化反應(yīng)速度與酶濃度成正比。它們之間的關(guān)系可以表示為：V=k[E]圖4-14酶濃度與反應(yīng)速率的關(guān)系每一種酶的催化反應(yīng)都有其適宜溫度范圍和最適溫度。在最適溫度條件下，酶的催化反應(yīng)速度達(dá)到最大，呈現(xiàn)出鐘罩形曲線。圖4-15溫度與反應(yīng)速度的關(guān)系（二）酶濃度的影響（三）溫度的影響4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)酶的催化作用與反應(yīng)液的pH值有很大關(guān)系。每一種酶都有其各自的適宜pH值范圍和最適pH。在最適pH值條件下，酶催化反應(yīng)速度達(dá)到最大。圖4-16pH值與反應(yīng)速度的關(guān)系由于在不同的pH值條件下，酶分子和底物分子中基團(tuán)的解離狀態(tài)發(fā)生改變，從而影響酶分子的構(gòu)象以及酶與底物的結(jié)合能力和催化能力。在極端的pH值條件下，酶分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而引起酶的變性失活。（四）pH值的影響4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)（五）抑制劑的影響酶的抑制劑是指使酶的催化活性降低或者喪失的物質(zhì)，分為可逆性抑制劑和不可逆抑制劑。⑴不可逆抑制劑是指與酶分子結(jié)合后，抑制劑難于除去，酶活性不能恢復(fù)。抑制劑與酶的必需基團(tuán)以共價(jià)鍵結(jié)合而引起酶失活。包括非專(zhuān)一性不可逆抑制的抑制劑和專(zhuān)一性不可逆抑制的抑制劑。①非專(zhuān)一性不可逆抑制的抑制劑作用于酶分子中一類(lèi)或幾類(lèi)基團(tuán)，而這些基團(tuán)中包含了必需基團(tuán)，因而引起酶失活。如金屬離子、烷化劑、有機(jī)磷化合物、有機(jī)砷化合物、有機(jī)汞、氰化物、青霉素等。②專(zhuān)一性不可逆抑制類(lèi)抑制劑選擇性很強(qiáng)，只能專(zhuān)一性地與酶活性中心的某些基團(tuán)不可逆結(jié)合，引起酶活性喪失。4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)⑵可逆性抑制劑與酶的結(jié)合是可逆的，只要將抑制劑除去，酶活性即可恢復(fù)。根據(jù)可逆性抑制作用的機(jī)理不同，酶的可逆性抑制作用可以分為競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制和反競(jìng)爭(zhēng)性抑制三種?？赡嫘砸种聘?jìng)爭(zhēng)性抑制非競(jìng)爭(zhēng)性抑制反競(jìng)爭(zhēng)性抑制4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)例：丙二酸是琥珀酸的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。丙二酸是琥珀酸脫氫酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。①競(jìng)爭(zhēng)性抑制：指抑制劑和底物競(jìng)爭(zhēng)與酶分子結(jié)合而引起的抑制作用。競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑與酶作用底物的結(jié)構(gòu)相似。它與酶分子結(jié)合以后，底物分子就不能與酶分子結(jié)合，從而對(duì)酶的催化起到抑制作用。4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)競(jìng)爭(zhēng)性抑制的效果強(qiáng)弱與競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的濃度、底物濃度以及抑制劑和底物與酶的親和力大小有關(guān)。隨著底物濃度增加，酶的抑制作用減弱。競(jìng)爭(zhēng)性抑制酶催化反應(yīng)的最大反應(yīng)速度Vm不變，而米氏常數(shù)Km增大。圖4-17線性競(jìng)爭(zhēng)性抑制的Km和Vm變化4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)②

非競(jìng)爭(zhēng)性抑制：指抑制劑與底物分別與酶分子上的不同位點(diǎn)結(jié)合，而引起酶活性降低的抑制作用。由于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑是與酶的活性中心以外的位點(diǎn)結(jié)合，所以，抑制劑的分子結(jié)構(gòu)可能與底物分子的結(jié)構(gòu)毫不相關(guān)。增加底物濃度也不能使非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用逆轉(zhuǎn)。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制的酶促反應(yīng)的最大反應(yīng)速度Vm減小，而米氏常數(shù)Km不變。圖4-18非競(jìng)爭(zhēng)性抑制的Km和Vm變化4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)圖4-19反競(jìng)爭(zhēng)性抑制的Km和Vm變化③反競(jìng)爭(zhēng)性抑制：在底物與酶分子結(jié)合生成中間復(fù)合物后，抑制劑再與中間復(fù)合物結(jié)合而引起的抑制作用。反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑不能與未結(jié)合底物的酶分子結(jié)合，只有當(dāng)?shù)孜锱c酶分子結(jié)合以后由于底物的結(jié)合引起酶分子結(jié)構(gòu)的某些變化，使抑制劑的結(jié)合部位展現(xiàn)出來(lái)，抑制劑才能結(jié)合并產(chǎn)生抑制作用。所以亦不能通過(guò)增加底物濃度使反競(jìng)爭(zhēng)抑制作用逆轉(zhuǎn)。反競(jìng)爭(zhēng)性抑制的酶促反應(yīng)的最大反應(yīng)速度Vm和米氏常數(shù)Km均減小。4.1酶學(xué)基礎(chǔ)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)④激活劑的影響：酶的激活劑或活化劑是指能夠增加酶的催化活性或使酶的催化活性顯示出來(lái)的物質(zhì)。常見(jiàn)的激活劑有Ca2+、Mg2+、Co2+、Zn2+、Mn2+等金屬離子和Cl-等無(wú)機(jī)負(fù)離子。例：氯離子（Cl-）是α-淀粉酶的激活劑，鈷離子（Co2+）和鎂離子（Mg2+）是葡萄糖異構(gòu)酶的激活劑等。有的酶也可以作為激活劑，通過(guò)激活劑的作用使酶分子的催化活性提高或者使酶的催化活性顯示出來(lái)。4.2酶的固定化1916年Nelson和Griffin最先發(fā)現(xiàn)了酶的固定化現(xiàn)象。1953年Grubhofer和Sohleith首先將酶等用重氮化聚氨基聚苯乙烯樹(shù)脂進(jìn)行固定。1969年日本的千煙一郎博士首次將固定化酶應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，開(kāi)辟了固定化酶工業(yè)化應(yīng)用的新紀(jì)元。固定化酶最初將水溶性酶與不溶性載體結(jié)合起來(lái)，成為不溶于水的酶的衍生物。后來(lái)發(fā)現(xiàn)也可以將酶包埋在凝膠內(nèi)或置于超濾裝置中，高分子底物與酶在超濾膜一邊，而反應(yīng)產(chǎn)物可以透過(guò)膜逸出。在這種情況下，酶本身是可溶的。1971年召開(kāi)的第一屆國(guó)際酶工程會(huì)議正式建議采用“固定化酶”（Immobilizedenzyme）的名稱(chēng)。4.2酶的固定化易于將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開(kāi)，固定化酶可重復(fù)使用；固定化酶具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，使反應(yīng)過(guò)程能夠管道化、連續(xù)化和自動(dòng)化；在大多數(shù)情況下，酶在固定化后穩(wěn)定性得到較大提高，可較長(zhǎng)期地使用或貯藏等。固定化酶與游離酶相比，具有明顯優(yōu)勢(shì)。4.2酶的固定化酶的固定化策略依據(jù)載體的性質(zhì)，酶的固定化方法主要分為吸附法、結(jié)合法、包埋法及交聯(lián)法四大類(lèi)。酶的固定化方法⑴吸附法利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面而使酶固定化的方法稱(chēng)為吸附法。吸附法包括物理吸附和離子結(jié)合法。優(yōu)勢(shì)：工藝簡(jiǎn)便、條件溫和，酶活性中心不易被破壞，酶高級(jí)結(jié)構(gòu)變化少，酶失活后可重新活化，載體價(jià)廉易得，再生反復(fù)使用，載體選擇范圍很大，吸附過(guò)程同時(shí)達(dá)到純化和固定化。缺點(diǎn)：酶與載體相互作用力弱，易受反應(yīng)介質(zhì)的pH、離子強(qiáng)度等的影響而從載體上脫落。4.2酶的固定化酶的固定化策略酶的固定化方法⑵包埋法單體和酶溶液混合，再借助引發(fā)劑進(jìn)行聚合反應(yīng)，將酶固定于載體材料的網(wǎng)格中，不需要化學(xué)修飾酶蛋白的氨基酸殘基，反應(yīng)條件溫和，很少改變酶結(jié)構(gòu)的固定化方法。固定化時(shí)保護(hù)劑和穩(wěn)定劑的存在不影響酶的包埋產(chǎn)率。包埋法又分為凝膠包埋法和微囊化法。圖4-20包埋法固定化酶示意圖4.2酶的固定化酶的固定化策略酶的固定化方法圖4-21結(jié)合法固定化酶示意圖⑶結(jié)合法酶蛋白分子上的功能團(tuán)和固相支持物表面上的反應(yīng)基團(tuán)之間形成化學(xué)共價(jià)鍵連接以固定酶的方法。根據(jù)酶與載體結(jié)合的化學(xué)鍵不同，結(jié)合法分為離子鍵結(jié)合法和共價(jià)鍵結(jié)合法。4.2酶的固定化酶的固定化策略酶的固定化方法圖4-22交聯(lián)法固定化酶示意圖⑷交聯(lián)法不使用載體，利用雙功能或多功能試劑在酶分子間、酶分子與惰性蛋白間，或酶分子與載體間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，以共價(jià)鍵制備固定化酶的方法。最常用的交聯(lián)試劑是戊二醛。4.2酶的固定化酶的固定化策略酶的固定化方法⑸其它固定化方法①熱處理法：將含酶細(xì)胞在一定溫度下加熱處理一段時(shí)間，使酶固定在菌體內(nèi)，而制備得到固定化菌體。例：將培養(yǎng)好的含葡萄糖異構(gòu)酶的鏈霉菌細(xì)胞在60～65℃的溫度下處理15min，葡萄糖異構(gòu)酶全部固定在菌體內(nèi)。②介孔材料固定法：以介孔材料為固定化載體。例：介孔分子篩是一種具有六方有序規(guī)整孔道排列和窄孔徑分布的新型材料，通過(guò)表面的可反應(yīng)基團(tuán)與酶分子結(jié)合。③納米材料固定法：納米載體比表面積大，如果能結(jié)合納米材料的磁、電等物理特性，在磁場(chǎng)或電場(chǎng)等條件下分離，將大大拓展酶的納米級(jí)固定化載體的適用范圍。例：磁性高分子微球4.2酶的固定化各酶固定化方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較不同的固定化方法具有不同的特點(diǎn)，因此有不同的適用范圍。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于一個(gè)特定酶的固定化來(lái)說(shuō)，要根據(jù)酶學(xué)性質(zhì)、固定化材料特性以及成本因素來(lái)選擇其固定化方法。特性物理吸附法離子結(jié)合法包埋法共價(jià)結(jié)合交聯(lián)法制備易易易難難結(jié)合力中弱強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)酶活力高高中中中底物專(zhuān)一性無(wú)變化無(wú)變化無(wú)變化有變化有變化再生能能不能不能不能固定化費(fèi)用低低中中高表4-1各酶固定化方法的比較4.2酶的固定化固定化酶的性質(zhì)變化酶分子固定化后，從游離態(tài)變?yōu)榻Y(jié)合態(tài)，處在一個(gè)與游離態(tài)酶完全不同的微環(huán)境中，微環(huán)境的許多性質(zhì)會(huì)因此而影響酶原有的性質(zhì)。固定化酶的穩(wěn)定性好，最適溫度升高。最適pH值因載體帶電性質(zhì)與產(chǎn)物性質(zhì)的影響而發(fā)生變化；載體的空間位阻，固定化酶的底物特異性可能有些不同，與底物分子量的大小有一定關(guān)系；固定化酶的米氏常數(shù)（Km）也會(huì)發(fā)生一定的改變。總體來(lái)說(shuō)，固定化酶性質(zhì)取決于酶、底物及載體材料的性質(zhì)：酶固定化后的變化主要是活性中心的氨基酸殘基、高級(jí)結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)等發(fā)生變化；載體影響主要是在固定化酶的周?chē)纬闪四軐?duì)底物產(chǎn)生立體影響的擴(kuò)散層及靜電相互作用等引起的變化。4.2酶的固定化輔酶的固定化輔酶（coenzyme）是一類(lèi)可以將化學(xué)基團(tuán)從一個(gè)酶轉(zhuǎn)移到另一個(gè)酶上的有機(jī)小分子，與酶較為松散地結(jié)合，對(duì)于特定酶的活性發(fā)揮是必要的。許多維生素衍生物，如核黃素、硫胺素和葉酸，都屬于輔酶。固定化輔酶最大挑戰(zhàn)在于如何完成固定化酶體系的輔酶原位再生。輔酶的相對(duì)分子量只有幾百，要將其包埋在半透膜比較困難，若將輔酶與不溶性載體結(jié)合，則不能在多個(gè)酶之間傳遞作用。目前都是輔酶高分子化來(lái)解決。輔酶的高分子化是先將輔酶的一定部位進(jìn)行修飾，引入適當(dāng)?shù)墓δ軋F(tuán)或間隔臂，生成輔酶衍生物，再與水溶性高分子結(jié)合。4.2酶的固定化輔酶的固定化輔酶的固定化一般需遵循三個(gè)原則：⑴選擇合適的載體，常用的是瓊脂糖、纖維素、合成高分子載體；⑵間隔臂選擇適當(dāng)，一般輔酶和載體間手臂為0.5~1.0nm；⑶考慮到輔酶的性質(zhì)，如疏水性、離子性和體積大小等。輔酶固定化在方法上與酶相似，主要應(yīng)用共價(jià)偶聯(lián)法。如溴化氰法，碳二亞胺法以及重氮偶聯(lián)法等。(a)輔酶與酶共固定在載體上在酶分子上圖4-23輔酶的固定化4.2酶的固定化固定化酶的表征⑴固定化酶（細(xì)胞）的活力指每毫克干重固定化酶（細(xì)胞）每分鐘轉(zhuǎn)化底物（或生成產(chǎn)物）的量。⑵偶聯(lián)率及相對(duì)活力偶聯(lián)率=（加入蛋白活力－上清液蛋白活力）／加入蛋白活力×100%相對(duì)活力=固定化酶總活力／（加入蛋白活力－上清液中未偶聯(lián)酶活力）×100%活力回收=固定化酶總活力／加入酶的總活力×100%⑶固定化酶（細(xì)胞）的半衰期指在連續(xù)測(cè)定時(shí)，固定化酶（細(xì)胞）的活力下降為最初活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作時(shí)間，以t1/2表示。沒(méi)有擴(kuò)散限制時(shí)，半衰期t1/2=0.693/KD，KD稱(chēng)為衰減常數(shù)。4.3非水相酶催化非水相酶催化概述傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，只有在水溶液中酶才具有催化活性。1984年美國(guó)麻省理工大學(xué)學(xué)者用脂肪酶在幾乎無(wú)水的有機(jī)溶劑中成功地催化合成了肽、手性醇、酯和酰胺，打破了認(rèn)為有機(jī)溶劑是酶的變性劑的這一傳統(tǒng)觀念。隨后許多學(xué)者相繼投入該研究領(lǐng)域，使得傳統(tǒng)酶學(xué)領(lǐng)域迅速成長(zhǎng)出一個(gè)全新的分支—非水酶學(xué)（NonaqueousEnzymology）。酶在非水介質(zhì)中進(jìn)行的催化作用稱(chēng)為酶的非水相催化反應(yīng)。在非水相中，酶分子受到非水介質(zhì)的影響，其催化特性與在水相中催化有著較大的不同。4.3非水相酶催化非水相酶催化概述指以含微量水的有機(jī)溶劑為介質(zhì)的反應(yīng)體系。例：吡啶中枯草桿菌蛋白酶催化的選擇性?；磻?yīng)。該反應(yīng)可以專(zhuān)一性得到1位選擇性?；a(chǎn)物，傳統(tǒng)的化學(xué)法是無(wú)法區(qū)分這些二級(jí)羥基的，顯示了非水相酶法合成的優(yōu)越性。（一）微水有機(jī)溶劑單相體系圖4-24枯草桿菌蛋白酶催化的選擇性酰化反應(yīng)酶的非水相體系主要包括以下幾種：4.3非水相酶催化非水相酶催化概述（二）水-有機(jī)溶劑單相體系指在水中加入有機(jī)助溶劑或共溶劑而形成的與水互溶的均相系統(tǒng)。常用助溶劑：二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、四氫呋喃、丙酮和低級(jí)醇等。由于形成均相系統(tǒng)，因此通常不會(huì)發(fā)生傳質(zhì)障礙。如果系統(tǒng)中有機(jī)溶劑的比例高過(guò)某閾值或親水性過(guò)強(qiáng)，將奪去酶分子表面的必需水，使酶失活。少數(shù)穩(wěn)定性很高的酶，如南極假絲酵母脂肪酶，只要水互溶有機(jī)溶劑中有極少量的水，就能保持它們的催化活性。水互溶有機(jī)溶劑體系還能降低反應(yīng)體系的冰點(diǎn)溫度，這是低溫酶學(xué)研究的內(nèi)容之一。4.3非水相酶催化非水相酶催化概述指由水和非極性有機(jī)溶劑組成的非均相反應(yīng)系統(tǒng)。酶溶解于水相，底物和產(chǎn)物溶解于有機(jī)相。常用的水不溶性溶劑有烴類(lèi)、醚、酯等。例：珊瑚諾卡菌（氧化酶）生物轉(zhuǎn)化烯烴產(chǎn)生的環(huán)氧化物被及時(shí)地轉(zhuǎn)移到有機(jī)相中，可使其對(duì)微生物的毒害降低。巨大芽孢桿菌環(huán)氧水解酶催化的縮水甘油苯基醚的對(duì)映體選擇性開(kāi)環(huán)水解反應(yīng)也適合于在兩相系統(tǒng)（異辛烷）中進(jìn)行，由于底物和產(chǎn)物大部分溶解在有機(jī)相中，因此可以減少其自發(fā)水解和對(duì)酶的抑制作用。（三）水-有機(jī)溶劑兩相體系4.3非水相酶催化非水相酶催化概述某些強(qiáng)極性有機(jī)溶劑可替代反應(yīng)體系中的微量“必須”水，使酶在“高燥”的有機(jī)介質(zhì)中仍然表現(xiàn)出一定的催化活性。這些強(qiáng)極性有機(jī)溶劑被稱(chēng)為“仿水溶劑”。仿水溶劑通過(guò)形成氫鍵與酶蛋白分子相互作用，使酶分子具有一定的柔性構(gòu)象，從而改善其催化活性和對(duì)映體選擇性。這類(lèi)仿水溶劑主要有乙腈、二甲基甲酰胺、乙二醇、丙三醇等。（四）仿水溶劑體系仿水溶劑只能作為輔助溶劑部分替代水，而不能完全替代水的作用。這是因?yàn)楦稍锏拿杆蠒r(shí)要經(jīng)過(guò)幾個(gè)階段，其中某個(gè)階段（可能是最初的離子化階段）是不可能完全被仿水溶劑替代的。仿水溶劑替代水的意義在可以控制和消除由水而引起的逆反應(yīng)和水解等副反應(yīng)。輔助溶劑的體積分?jǐn)?shù)反應(yīng)初速度/[umol/(L·h·mg)]輔助溶劑的體積分?jǐn)?shù)反應(yīng)初速度/[umol/(L·h·mg)]無(wú)01%水+9%甘油8201%水191%水+9%乙二醇單醚1404%水35001%水+9%乙二醇二甲醚601%水+9%甲酰胺38001%水+9%二甲基甲酰胺(DMF)511%水+9%乙二醇15009%甲酰胺04.3非水相酶催化非水相酶催化概述（五）微乳液/反膠束體系微乳液是由水、表面活性劑以及非極性有機(jī)溶劑等構(gòu)成的宏觀均勻、微觀多相的熱力學(xué)穩(wěn)定體系。低水含量的油包水（W/O）微乳液又稱(chēng)為反膠束。水含量少（Wo<15）的聚集體通常稱(chēng)為反膠束；水含量多（Wo>15）的聚集體通常稱(chēng)為微乳液。圖4-25反膠束結(jié)構(gòu)示意圖4.3非水相酶催化非水相酶催化概述（六）超臨界流體體系超臨界流體是處于臨界溫度和臨界壓力以上，介于氣體和液體之間的高密度流體。其具有和液體同樣的凝聚力、溶解力；然而其擴(kuò)散系數(shù)又接近于氣體，是通常液體的近百倍。例：用作超臨界流體的溶劑有氟利昂、烷烴類(lèi)（甲烷，乙烯，丙烷）、無(wú)機(jī)化合物（CO2，H2O，N2O）等。酶在這些溶劑中具有與在親脂性有機(jī)溶劑中一樣的穩(wěn)定，適于多數(shù)酶催化的酯化、轉(zhuǎn)酯、醇解、水解、羥化和脫氫等反應(yīng)。4.3非水相酶催化非水相酶催化概述（七）離子液體體系離子液體（Ionicliquid,IL）是只由離子構(gòu)成且在常溫下呈液態(tài)的化合物，為一種低熔點(diǎn)的鹽，其性質(zhì)依賴(lài)于它所包含的陰陽(yáng)離子。離子液體沒(méi)有可觀測(cè)蒸氣壓，熱穩(wěn)定性好，溶解多種混合物，還可以與多種溶劑組成兩相體系。離子液體的極性、親水性/親脂性和溶解性能可以通過(guò)改變不同的正負(fù)離子及其烷基碳鏈的長(zhǎng)短進(jìn)行調(diào)節(jié)，因此又被稱(chēng)為可設(shè)計(jì)的溶劑。例：溴化乙基吡啶、氯化1-甲基-3-乙基咪唑等。圖4-26幾種常見(jiàn)的離子液體4.3非水相酶催化非水相酶催化概述（八）擬低共熔體系兩種固態(tài)不互溶的底物按一定比例混合時(shí)在一定溫度下（低共熔點(diǎn)）能形成低共熔的狀態(tài)。固、液同時(shí)存在，酶促反應(yīng)能在高底物濃度下進(jìn)行。然而既適合酶促反應(yīng)的溫度及反應(yīng)用酶，又符合嚴(yán)格的物化概念上的低共熔二元反應(yīng)底物體系，實(shí)際上是很難找到的。往往加入極少量的第三、第四液相組份來(lái)產(chǎn)生反應(yīng)所需的液相形成固-固-液懸浮體系，或一種反應(yīng)底物以液態(tài)存在，另一種反應(yīng)底物以固態(tài)存在而形成液-固懸浮體系，即擬低共熔體系（Pseudoeutecticsystems）。4.3非水相酶催化非水相酶催化概述（九）無(wú)溶劑體系無(wú)溶劑有機(jī)合成體系有以下幾種形式：（1）反應(yīng)物均為液體（2）其中的一種反應(yīng)物為固態(tài)，一種為液體（3）兩種反應(yīng)物均為固體（4）一種反應(yīng)物為氣體，另一種為固體。

其中后兩種形式稱(chēng)為固態(tài)反應(yīng)體系。4.3非水相酶催化非水相酶催化概述（九）無(wú)溶劑體系無(wú)溶劑合成是有機(jī)合成的一種新方法。無(wú)溶劑條件下的酶催化反應(yīng)表現(xiàn)出明顯的優(yōu)越性：1）克服了溶劑對(duì)酶催化活性和選擇性的影響；2）底物濃度達(dá)最大值而不必考慮底物濃度對(duì)酶活性的影響；3）具有污染少、成本低、產(chǎn)率高、反應(yīng)過(guò)程和處理過(guò)程簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。4.3非水相酶催化非水相酶催化概述（十）氣相體系采用生物酶的氣固相反應(yīng)器已用于單步的生物轉(zhuǎn)化，所用生物酶包括氫化酶、醇氧化酶、醇脫氫酶、脂肪酶等。酶用于氣相催化是一種可行的新技術(shù)，未來(lái)可能用于生產(chǎn)香料一類(lèi)的揮發(fā)性產(chǎn)品，也可用于移出氣體中的有毒物質(zhì)，以及用于生物傳感器等。對(duì)于生物酶和細(xì)胞的氣相催化反應(yīng)研究還有大量的工作要做。4.3非水相酶催化非水相酶催化的反應(yīng)類(lèi)型⑴氧化反應(yīng)：醇、酚以及羧酸等的氧化⑵還原反應(yīng)：催化醛類(lèi)或酮類(lèi)還原成醇類(lèi)（一）氧化-還原反應(yīng)4.3非水相酶催化非水相酶催化的反應(yīng)類(lèi)型（二）轉(zhuǎn)移反應(yīng)4.3非水相酶催化非水相酶催化的反應(yīng)類(lèi)型（三）醇解/氨解反應(yīng)

例：假單胞脂肪酶催化酸酐醇解生成二酸單酯化合物：再如脂肪酶4.3非水相酶催化非水相酶催化的反應(yīng)類(lèi)型（四）合成反應(yīng)（五）異構(gòu)反應(yīng)（六）裂合反應(yīng)4.3非水相酶催化非水相酶催化的影響因素有機(jī)溶劑主要通過(guò)以下三種途徑發(fā)生作用：（1）有機(jī)溶劑與酶直接發(fā)生作用，酶分子本身的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)及表面結(jié)構(gòu)發(fā)生變化：改變蛋白分子的動(dòng)態(tài)移動(dòng)性來(lái)影響酶的活力；酶分子與溶劑的直接接觸，蛋白質(zhì)分子表面結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；減少整個(gè)活性中心的數(shù)量（活性中心滴定法測(cè)定），溶劑為非極性時(shí)影響更明顯。（2）有機(jī)溶劑可以直接和酶分子周?chē)乃嗷プ饔茫恍Z取酶表面的必需水而導(dǎo)致酶失活。（3）有機(jī)溶劑和能擴(kuò)散的底物或反應(yīng)產(chǎn)物相互作用影響反應(yīng)的進(jìn)行。（一）有機(jī)溶劑4.3非水相酶催化非水相酶催化的影響因素水在酶催化反應(yīng)中發(fā)揮著雙重作用：⑴水分子直接或間接地通過(guò)氫鍵及范德華力等非共價(jià)鍵作用來(lái)維持酶的催化活性所必需的構(gòu)象；⑵水是導(dǎo)致酶的熱失活的重要因素，有水存在時(shí)隨著溫度的升高酶分子會(huì)發(fā)生變化而失活。

因此，在非水相酶反應(yīng)體系中進(jìn)行的酶促反應(yīng)的最適含水量不僅與酶的種類(lèi)及用量、底物濃度有關(guān)，也與選用的溶劑有關(guān)。各種酶因結(jié)構(gòu)不同，維持酶活性構(gòu)象的必需水也不同，大部分酶需較高的水活度aw才表現(xiàn)較好的活力；不同反應(yīng)酶所需的最適水量也不同。（二）水4.3非水相酶催化非水相酶催化的影響因素添加劑主要分為以下幾個(gè)類(lèi)型：⑴無(wú)機(jī)鹽類(lèi)添加劑：改變酶在非水相介質(zhì)中的構(gòu)象。⑵有機(jī)助溶劑：增加疏水性底物的溶解度，從而增加底物濃度。⑶多醇類(lèi)添加劑：較強(qiáng)的親水性影響酶必需水層的微環(huán)境，提高酶催化活性的作用稱(chēng)為“溶劑活化”，抑制酶催化活性的作用稱(chēng)為“溶劑抑制”。⑷表面活性劑：可影響底物的分散狀況；離子型表面活性劑因其帶電基團(tuán)與酶分子間的靜電作用影響酶構(gòu)象；非離子表面活性劑與酶分子間僅有氫鍵和疏水作用，影響較小。（三）添加劑4.3非水相酶催化非水相酶催化的影響因素生物印跡（bioimprinting）是指以天然生物材料如蛋白質(zhì)和多糖為骨架進(jìn)行分子印跡而產(chǎn)生對(duì)印跡分子具有特異性識(shí)別空腔。利用酶與配體的相互作用，誘導(dǎo)、改變酶的構(gòu)象，制備具有結(jié)合該配體及其類(lèi)似物能力的“新酶”，即印跡酶。酶在含有其配基的緩沖液中，肽鍵和配體之間的相互作用使酶的構(gòu)象改變，這種新構(gòu)象在去除配體后在無(wú)水有機(jī)溶劑中仍可保持，即具有“記憶”性。例：當(dāng)枯草桿菌蛋白酶從含有競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑（N-Ac-Tyr-NH2）的水溶液中凍干出來(lái)后，再將抑制劑除去，該酶在辛烷中催化酯化反應(yīng)的速度比不含抑制劑的水溶液中凍干出來(lái)的酶高100倍，但在水溶液中其活性與未處理的酶相同。（四）生物印跡4.3非水相酶催化非水相酶催化的影響因素利用兩親分子共價(jià)或非共價(jià)修飾酶分子表面，可以增加酶表面的疏水性，使酶均一地分散于有機(jī)溶劑，從而提高酶的催化效率和穩(wěn)定性。智能水凝膠是一種對(duì)環(huán)境敏感的能夠顯著地溶脹于水中但并不溶解的親水性聚合物。用智能水凝膠共價(jià)修飾酶，使酶能在均相條件下進(jìn)行催化，反應(yīng)結(jié)束后酶又能從體系中沉淀出，因此可看作一種兼有可溶性酶均相催化和固定化酶穩(wěn)定性高的修飾酶。（五）化學(xué)修飾4.3非水相酶催化非水相酶催化的影響因素（六）固定化載體在有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行酶催化反應(yīng)時(shí)，使用合適的載體對(duì)酶進(jìn)行固定可以調(diào)節(jié)和控制酶的活性與選擇性。例：介面酶類(lèi)如脂肪酶等直接加入到有機(jī)溶劑中進(jìn)行反應(yīng)時(shí)它們常聚集成團(tuán)而不利于發(fā)揮催化作用，因此固定化是非常必要的。酶經(jīng)固定化后可以提高其在有機(jī)溶劑中的分散性和熱力學(xué)穩(wěn)定性，有利于酶的回收和連續(xù)化生產(chǎn)。4.3非水相酶催化非水相酶催化的影響因素（七）溫度、pH與離子強(qiáng)度⑴溫度的影響：

溫度較低時(shí)升高溫度能提高酶促反應(yīng)速度；

溫度過(guò)高則會(huì)導(dǎo)致酶失活；

溫度對(duì)酶的選擇性產(chǎn)生影響，溫度低時(shí)選擇性高。⑵pH與離子強(qiáng)度是影響酶催化的重要因素，其決定酶分子活性中心基團(tuán)的解離狀態(tài)和底物分子的解離狀態(tài)，從而影響酶與底物的結(jié)合和催化反應(yīng)。4.3非水相酶催化非水相酶催化的影響因素（八）超聲輻射超聲對(duì)酶促反應(yīng)的作用主要包括機(jī)械作用、加熱作用和空化作用。適度超聲：

降低溶液粘度和表面張力，從而加強(qiáng)傳質(zhì)；

使酶分子的構(gòu)象微小變化，使其超微結(jié)構(gòu)更具柔性，有利于非水介質(zhì)中的底物分子進(jìn)入酶活性中心，也有利于產(chǎn)物分子進(jìn)入介質(zhì)；

使生成的水再分配，避免新生成的水在酶分子表面形成較厚的水化層而影響傳質(zhì)，并使酶的有效表面積增加。持續(xù)超聲：導(dǎo)致有機(jī)溶劑中少量水分子的重新分布，阻止酶分子周?chē)さ男纬?，從而?duì)酶促反應(yīng)產(chǎn)生負(fù)面影響。4.3非水相酶催化非水相酶催化的影響因素（九）其它技術(shù)蛋白質(zhì)工程技術(shù)（定點(diǎn)突變）、進(jìn)化酶技術(shù)、抗體酶技術(shù)、模擬酶技術(shù)等都是改變酶在有機(jī)介質(zhì)（非天然條件）中的催化活性、穩(wěn)定性和選擇性的重要手段，近年來(lái)這方面的研究也得到了較快的發(fā)展。例：枯草桿菌蛋白酶經(jīng)六點(diǎn)定位突變后，在二甲酰胺中的穩(wěn)定性提高了60倍；南極假絲酵母脂肪酶活性中心附近的氨基酸殘基突變后，在環(huán)己烷中催化4-庚醇和丁酸乙烯酯的選擇性常數(shù)提高了270倍。4.4酶與酶工程的應(yīng)用酶與酶工程的應(yīng)用概況目前業(yè)已發(fā)現(xiàn)的酶有5000種左右，其中已經(jīng)利用的有150種左右，工業(yè)生產(chǎn)的酶約60多種，而大量生產(chǎn)的只有20多種，占已知酶的很小一部分（約0.4%），其中80%為水解酶，而自然界中大量存在的生化反應(yīng)是氧化還原反應(yīng)，氧化還原酶的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值急待開(kāi)發(fā)。隨著遺傳工程的普及，現(xiàn)在工業(yè)用微生物酶的80%以上已是