治療性HPV疫苗研究進(jìn)展 2023

治療性HPV疫苗研究進(jìn)展目前，宮頸癌是全球女性的第三大常見癌癥，全世界每年有近50萬名女性確診患有宮頸癌，其中超過25萬人死亡。高危人乳頭瘤病毒（HPV）感染是宮頸和肛門生殖器惡性腫瘤的必要因素，據(jù)估計，HPV引發(fā)的相關(guān)癌癥占所有人類癌癥的5%[1]。盡管目前的HPV疫苗在預(yù)防感染和腫瘤疾病方面非常有效，但是他們不能清除已經(jīng)確定的感染[2]。因此，目前人們研究的方向是治療性疫苗的開發(fā)，即通過引發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答以治療特定的感染和惡性腫瘤。治療性疫苗與預(yù)防性疫苗的不同之處在于它們旨在產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的免疫而不是中和抗體。當(dāng)前，人們已經(jīng)嘗試了幾種用于開發(fā)治療性疫苗的策略，包括活載體、核酸、肽、基于蛋白質(zhì)和基于細(xì)胞的疫苗以及組合方法，其中有若干種候選疫苗進(jìn)入臨床試驗。本文將對目前關(guān)于HPV治療性疫苗的研究進(jìn)展做一個簡要綜述。類型，包括引起生殖器疣的HPV-6/11/40/42/43/44/54/61/72；以及高風(fēng)險（high-risk）類型，包括HPV-16/18/31/35/39/45/51/52/56/58/66。其中，HPV-16和HPV-18已經(jīng)被確定為兩種最常見的hrHPV類型，分別占約62.6%和15.7%[5]。這兩種hrHPV類型導(dǎo)致病例中80-86％的外陰和陰道癌，89-95％的口咽癌，93％的肛門癌和63-80%的陰莖癌[6]。圖1，高危型和低危型HPVintraepitheliallesions，SILs）的發(fā)生；在子宮頸，這被稱（cervicalintraepithelialneoplasia，CIN在外陰被稱為外陰上皮內(nèi)瘤變（vulvalintraepithelialneoplasia，VIN）。SILs會發(fā)展為惡性腫瘤[7]。02HPV可破壞細(xì)胞周期，引起細(xì)胞癌變HPV病毒是一種小型、無包膜的雙鏈DNA病毒，其基因組大小約為8kb，編碼負(fù)責(zé)病毒DNA復(fù)制（E1,E2）、轉(zhuǎn)錄（E2）和致癌轉(zhuǎn)化（E5,E6,E7）的蛋白，以及病毒衣殼蛋白。病毒在pH=3-7時穩(wěn)定，在70℃下滅活，并在50℃以上的溫度下30分鐘后被殺死。它耐溶劑，酸和X射線。通常，病毒感染導(dǎo)致細(xì)胞的破壞;事實上，它也可能導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)展。HPV病毒通過解剖學(xué)上可接觸的位置感染基底上皮細(xì)胞，例如皮膚、生殖器官和口咽區(qū)域的微小病變等。衣殼蛋白L1和L2附著在上皮細(xì)胞受體上，最終其基因組進(jìn)入受感染細(xì)胞的細(xì)胞核，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。病毒體成熟之后進(jìn)行組裝和釋放，并且與與上皮細(xì)胞生命周期結(jié)束時衰老細(xì)胞的自然脫落一致[9]。圖2典型hr-HPV的生命周期持續(xù)性的感染會可能導(dǎo)致病毒基因組整合到宿主細(xì)胞中，誘發(fā)侵襲性宮頸癌。在典型的hrHPV致癌過程中，HPV基因組被整合到宿主的染色體DNA中，E2序列在基因組線性化過程中被打亂。而E2蛋白是E6和E7的轉(zhuǎn)錄抑制因子，因此一旦E2被破壞，E6和E7就能夠在宿主體內(nèi)順利轉(zhuǎn)錄。E6蛋白隨后促進(jìn)宿主凋亡調(diào)節(jié)蛋白p53的降解，激活端粒酶，從而延長細(xì)胞壽命；E7蛋白以腫瘤抑制因子視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（pRb）為降解目標(biāo)，導(dǎo)致細(xì)胞生命周期向S期過渡，從而造成宿主細(xì)胞基因組復(fù)制。E6和E7兩類調(diào)控蛋白通過破壞細(xì)胞周期，延長宿主細(xì)胞壽命，造成基因組不穩(wěn)定，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。03上市HPV疫苗均為預(yù)防性疫苗治療性疫苗仍在臨床開發(fā)中目前，市面上共有三種HPV疫苗，均為預(yù)防性的：二價HPV-16/18疫苗、四價HPV-6/11/16/18疫苗和九價HPV-6/11/16/18/31/33/45/52/58疫苗，均靶向HPV的L1衣殼蛋白，然而該蛋白并不在受感染的基底上皮細(xì)胞中表達(dá)，因此這些疫苗無法有效消除已存在的感染[14]。因此，大量已感染HPV的人無法從現(xiàn)有疫苗中獲益，亟需開發(fā)能夠消除現(xiàn)存感染的治療性HPV疫苗。當(dāng)前，研究者們已經(jīng)開發(fā)了幾類不同的HPV治療性疫苗，包括活載體、核酸、肽、基于蛋白質(zhì)和基于細(xì)胞的疫苗等，并在臨床試驗中獲得了良好結(jié)果。DNA疫苗DNA疫苗接種涉及將編碼目的蛋白質(zhì)的質(zhì)粒DNA遞送到宿主組織中，隨后通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和能夠進(jìn)入細(xì)胞處理機(jī)制的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。具有生產(chǎn)簡單、成本較低、熱穩(wěn)定性好的優(yōu)勢。VGX-3100由兩個DNA質(zhì)粒組成，分別編碼HPV-16和HPV-18的優(yōu)化合成共識基因E6和E7，由INOVIO公司(NASDAQ:INO)開發(fā)。2023年3月，VGX-3100治療子宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變的III期臨床topline數(shù)據(jù)公布，治療組27.6%的患者達(dá)到組織病理學(xué)轉(zhuǎn)歸而且病毒清除的主要終點，安慰劑組則只有8.7%，達(dá)到預(yù)設(shè)主要、次要終點，且安全性良好，沒有與治療相關(guān)的嚴(yán)重不良事件發(fā)生。圖3VGX-3100作用機(jī)制肽疫苗基于肽的治療性疫苗具有穩(wěn)定性、安全性和大規(guī)模生產(chǎn)的可行性[25]。它們可分為特定表位（短）肽和合成長肽（SLPs）疫苗。由于肽疫苗的免疫原性很差，所以一般需要佐劑化。PepCan由包括HPV-16E6蛋白的四種合成肽組成，以念珠菌屬（Candida）皮試劑為新型佐劑。實驗中，65％的受體內(nèi)能檢測到由疫苗誘導(dǎo)的對E6的免疫應(yīng)答。目前，PepCan治療宮頸高級鱗狀上皮內(nèi)病變的II期(NCT02481414)。另一種合成長肽（SLP）疫苗ISA101由跨越整個HPV-16E6和E7癌蛋白的13種合成長肽組成。實驗證明，所有患者均存在疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)，事后分析表明HPV-16特異性免疫反應(yīng)的大小與疫苗接種的臨床療效相關(guān)[27]。圖4PepCan二期臨床登記信息蛋白質(zhì)疫苗基于蛋白質(zhì)的疫苗內(nèi)有許多CD4+和CD8+T表位，并規(guī)避了短肽疫苗接種的缺點，不再受到MHC限制。然而，抗原優(yōu)先通過MHCII類呈遞，這導(dǎo)致產(chǎn)生抗體而不是效應(yīng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTLs）。因此，我們需要通過一些輔助手段加強(qiáng)內(nèi)源性加工，或?qū)⒖乖邢虻紻C細(xì)胞，以達(dá)到誘發(fā)細(xì)胞免疫的目的。GTL001（Procervix）包含來自HPV-16和18的E7蛋白，它們各自與來自百日咳博德特氏菌（Bordetellapertussis，CyaA）的解毒腺苷酸環(huán)化酶融合并由咪喹莫特佐劑化。CyaA的N原子端與表達(dá)在APC上的黏附分子CD11b相結(jié)合。經(jīng)過試驗數(shù)據(jù)測定發(fā)現(xiàn)，該疫苗與對照組（只給安慰劑）病毒清除率的差異沒有達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義，最終結(jié)果是GTL001和安慰劑組的高級病變進(jìn)展率相同[28]（NCT01957878）。因此，進(jìn)一步的臨床開發(fā)被終止。16/18/45/31/33/52的修飾的E7蛋白。人們已經(jīng)在近交系和遠(yuǎn)交系小鼠和犬類動物中評估了GTL002的臨床前免疫原性。六種HPV基因型的E7蛋白均能誘導(dǎo)T細(xì)胞進(jìn)行特異性免疫應(yīng)答，并且已經(jīng)通過廣泛使用的TC-1腫瘤攻擊模型證明了疫苗的體內(nèi)功效[29]。以病毒為載體的疫苗由于它們將自身遺傳信息轉(zhuǎn)導(dǎo)到宿主細(xì)胞中以進(jìn)行復(fù)制的天然傾向，病毒是開發(fā)治療性HPV疫苗的一種具有吸引力的方式。使非必需病毒基因被來自目的病原體的免疫原性蛋白質(zhì)的外源基因編碼取代，然后重組病毒載體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)它們的靶細(xì)胞，隨后在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)編碼的抗原。產(chǎn)生的抗原具有活性并且其載體和多肽將被細(xì)胞表面的MHCI類分子呈遞出來。此外，病毒核酸內(nèi)含有刺激先天免疫反應(yīng)的PAMP，能夠進(jìn)一步誘發(fā)細(xì)胞免疫。但是，病毒載體疫苗有一個最大的缺點，就是存在載體特異性免疫：預(yù)先存在的抗體可以阻止載體被靶細(xì)胞攝入，隨著疫苗接種次數(shù)的增加，機(jī)體的載體特異性免疫作用越強(qiáng)，導(dǎo)致疫苗無效。目前，人們利用最廣泛的病毒載體是腺病毒（adenoviruses,Ad）及其衍生病毒、甲病毒（alphaviruses）和牛痘病毒（如經(jīng)過修飾的安卡拉牛痘疫苗，ModifiedVacciniaAnkara，MVA）。圖5常見病毒載體特性1）以腺病毒為載體腺病毒在許多不同的細(xì)胞類型中表現(xiàn)出廣泛的親和力，這是腺病毒成為基因治療的先驅(qū)并隨后發(fā)展為疫苗載體的原因之一。腺病毒基因組有五個早期區(qū)域：E1A、E1B、E2、E3和E4。E1A蛋白可激活其他病毒基因，對病毒復(fù)制起著非常重要的作用。只要使得該區(qū)域的基因缺失或是用目標(biāo)基因替換，就能得到適于人使用的安全的病毒載體。因此，人類和動物的大多數(shù)研究均使用了E1基因缺失的病毒作為載體。而E2、E3、E4編碼序列的缺失則會增加目的基因片段插入的能力。進(jìn)入細(xì)胞核后，腺病毒會在局部保留，而不是整合到宿主基因組中，從而將插入性腫瘤發(fā)生的風(fēng)險降至最低。腺病毒載體可以通過各種系統(tǒng)途徑和粘膜途徑進(jìn)行給藥，并且能夠同時轉(zhuǎn)導(dǎo)靜止和活躍分裂的細(xì)胞。由于腺病毒在人類中普遍存在，所以機(jī)體內(nèi)預(yù)先存在的針對腺病毒的特異性反應(yīng)非常普遍：生活在歐洲和美國的成年人中，高達(dá)60%的人對5型腺病毒（Ad5）具有高水平表達(dá)的中和抗體，而Ad5是人類血清型和疫苗試驗中最常用的病毒載體。因此，人們轉(zhuǎn)而尋找相似的替代品，以減弱機(jī)體本身對病毒載體的特異性反應(yīng)。來自黑猩猩的腺病毒（ChAd）由于其在人群中的低/無血清陽性率和與人Ad5相當(dāng)?shù)拿庖咝ЯΧM(jìn)入臨床[30]。最近，Khan等人[31]進(jìn)行了利用罕見的人類腺病毒Ad26和Ad35，編碼E2、E6和E7作為融合蛋白，治療HPV-16/18相關(guān)疾病的研究。在臨床前研究中，觀察到小鼠強(qiáng)大的T細(xì)胞免疫原性和抗腫瘤的能力。2）以痘病毒為載體痘病毒具有龐大而穩(wěn)定的基因組，可以支持大量轉(zhuǎn)基因DNA的穩(wěn)定表達(dá)，同時保留轉(zhuǎn)錄和翻譯能力。在感染細(xì)胞被免疫系統(tǒng)清除之前，重組基因表達(dá)約7天。它們的整個生命周期發(fā)生在體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，這使插入誘變的風(fēng)險最小化。此外，痘病毒通過被動膜融合感染細(xì)胞，從而賦予哺乳動物細(xì)胞廣泛的親和力，包括單核細(xì)胞和發(fā)育不成熟的樹突狀細(xì)胞。廣泛使用具有復(fù)制能力的牛痘和后來的MVA作為天花疫苗，為痘病毒在疫苗中充當(dāng)載體對人類是安全的提供了有效證據(jù)。所以，MVA和其他減毒牛痘株（NYVAC）不僅能夠以低成本投入生產(chǎn)，并已通過皮下、鼻內(nèi)、陰道內(nèi)和直腸內(nèi)途徑安全使用。對于目前處于研發(fā)狀態(tài)的兩種疫苗，MVAE2和TG4001。前者在任何研究中都沒有提供關(guān)于E2特異性T細(xì)胞的描述，并且因為在這些研究中沒有使用對照疫苗，疫苗的真正效力尚不能完全確定[32]；后者由轉(zhuǎn)基因公司研制，包含編碼HPV-16E6/E7和人IL2的重組MVA，由于疫苗效力遠(yuǎn)低于切除/消融治療的效果[33]，所以TG4001于2012年被停止開發(fā)。3）以細(xì)菌為載體的疫苗減毒活細(xì)菌載體具有誘導(dǎo)粘膜和全身體液免疫及細(xì)胞介導(dǎo)免疫的能力。給藥后，重組細(xì)菌極大幾率會被巨噬細(xì)胞和其他抗原呈遞細(xì)胞所吞噬。革蘭氏陰性細(xì)菌中的脂多糖、革蘭氏陽性細(xì)菌中的脂壁酸、肽聚糖和鞭毛蛋白等保守分子模式可被PRRs識別，從而觸發(fā)先天免疫反應(yīng)。細(xì)菌的衰減是通過刪除毒力調(diào)節(jié)系統(tǒng)或芳香氨基酸生物合成途徑所涉及的必要基因來實現(xiàn)的。這些突變使細(xì)菌不能在宿主中繁殖，同時保留其合成編碼抗原的能力，故對人體無害。用于疫苗開發(fā)的最常用的細(xì)菌載體是單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes，Lm這是一種革蘭氏陽性細(xì)胞內(nèi)兼性厭氧菌。一旦進(jìn)入吞噬體，Lm菌將分泌膜活性毒力因子LLO和磷脂酶C，通過降解吞噬溶酶體膜，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)源性抗原加工途徑。Lm能夠引發(fā)持久的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。一旦在吞噬體中表達(dá)，Lm編碼的蛋白質(zhì)也可以直接呈遞給MHCII類分子，進(jìn)而誘導(dǎo)CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答[34]。細(xì)菌載體生產(chǎn)相對簡單且廉價，適合于大規(guī)模生產(chǎn)并且室溫狀態(tài)下能夠保持穩(wěn)定狀態(tài)