參附注射液對(duì)兔離體心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

參附注射液對(duì)兔離體心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

隨著心肌保護(hù)方法的發(fā)展，心臟肌缺血再注損傷機(jī)制中的軸向作用越來越受到重視。參附注射液(SFI)的主要有效成分為人參皂甙、水溶性生物堿。有研究表明SFI對(duì)心肌缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用,但其作用機(jī)制尚無定論,用藥劑量、給藥方式等需進(jìn)一步探討。本研究旨在評(píng)價(jià)含不同濃度SFI的St.Thomas停跳液對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用,并在線粒體水平上探討其機(jī)制。體外肌肉生化指標(biāo)動(dòng)物選擇及分組成年日本大耳白兔40只,體重3.8～4.2kg。隨機(jī)分為5組,每組8只。對(duì)照組:用St.Thomas停跳液使心臟停搏;SF1、SF5、SF10、SF15組:分別用含1%、5%、10%、15%SFI(批號(hào)020303,雅安三九藥業(yè)有限公司)的St.Thomas停跳液[(mmol/L):NaCl100.0、KCl16.0、MgCl2·6H2O16.0、CaCl2·2H2O1.2、NaHCO310.0、pH7.4～7.8]使心臟停搏。腹腔注射硫噴妥鈉40mg/kg麻醉,耳緣靜脈注射4mg/kg肝素后,迅速開胸取心臟,浸入4℃K-H液中,排盡殘血后將心臟懸掛于Langendorff灌注裝置上,制備全心缺血再灌注模型。以70cmH2O(1cmH2O=0.098kPa)灌注壓經(jīng)主動(dòng)脈灌注37℃K-H液[(mmol/L):NaCl118.5、NaHCO325.0、KH2PO41.2、KCl4.8、MgSO4·7H2O1.2、CaCl2·2H2O2.0、葡萄糖11.1,pH7.2～7.6],灌注中持續(xù)通入混合氣(O2:CO2=95%:5%),并將心臟移入37℃保溫缸內(nèi)。平衡灌注30min時(shí)各組分別以不同停跳液20ml使心臟停搏,停灌45min(37℃保溫、保濕)再灌注40min。線粒體的分離再灌注40min,快速取下心臟,取左、右心室肌剪碎,用預(yù)冷的4℃勻漿介質(zhì)(250mmol/L蔗糖、10mmol/LTris-Hcl,pH7.4)制成10%組織勻漿。4℃下1000×g離心10min棄去沉淀,重復(fù)一次后取上清液10000×g再離心10min,沉淀即為純化的線粒體。指標(biāo)測(cè)定收集再灌注10min時(shí)冠脈流出液5ml,7170A全自動(dòng)生化分析儀(Hitachi公司,日本)免疫抑制法測(cè)定磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性;考馬斯亮蘭法(試劑盒由南京建成生物有限公司提供)測(cè)定線粒體蛋白含量;取線粒體懸浮液1ml,蒸干后馬弗爐灰化,分析純濃硝酸、高氯酸加熱消化,以同時(shí)測(cè)得的線粒體蛋白含量定標(biāo),定容后Z-5000型原子吸收光譜儀(Hitachi公司,日本)測(cè)定線粒體Ca2+含量,硫代巴比妥酸法(試劑盒由南京建成生物有限公司提供)測(cè)定線粒體丙二醛(MDA)含量。線粒體形態(tài)學(xué)觀察取右室流出道0.2cm×0.2cm×0.5cm全層心室肌標(biāo)本,常規(guī)固定、染色、超薄切片后H-600透射電鏡(Hitachi公司,日本)觀察心肌超微結(jié)構(gòu)并行線粒體評(píng)分,參照Flameng法,每個(gè)標(biāo)本取5個(gè)不同視野,每個(gè)視野隨機(jī)選擇20個(gè)線粒體行Flameng評(píng)分。參照文獻(xiàn),選用比表面(δ)和面數(shù)密度(NA)為指標(biāo),CM-2000B生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)根據(jù)體視學(xué)原理進(jìn)行線粒體定量分析。計(jì)算公式為:NA=Nx/Ar,δ=Sx/Vx。Ar為參照系的截面積,Nx為參照系中線粒體截面數(shù)目,Sx為線粒體表面積,Vx為其體積。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組小鼠心肌組織病理學(xué)檢測(cè)與對(duì)照組比較,SF1、SF5、SF10組冠脈流出液中CK-MB活性降低,線粒體MDA、Ca2+含量及Flameng評(píng)分降低,線粒體NA增高,SF5、SF10組線粒體δ增高,SF15組冠脈流出液CK-MB活性增高,線粒體MDA含量降低,Ca2+含量升高(P<0.05或0.01)。見表1。電鏡下對(duì)照組及SF1組肌原纖維斷裂、溶解,Z線增寬、模糊,出現(xiàn)異常收縮帶,線粒體腫脹變形、基質(zhì)密度降低、嵴排列紊亂,見圖1,2。SF5和SF10組線粒體腫脹不明顯、排列較整齊,基質(zhì)密度均勻,嵴排列緊密,內(nèi)外膜清晰可見,見圖3,4。而SF15組線粒體腫脹變形明顯,基質(zhì)呈空泡狀,部分嵴解體、消失,甚至線粒體膜破裂、內(nèi)容物流失,見圖5。變質(zhì)劑對(duì)心肌缺血再灌注損傷的作用本研究采用經(jīng)典的Langendorff灌注裝置制備離體心臟缺血再灌注模型,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)將SFI加入停跳液中,當(dāng)SFI濃度>15%時(shí),再灌注后心臟復(fù)跳率明顯降低,因此本研究選擇1%～15%濃度范圍篩選適宜濃度。本研究中對(duì)照組心肌病理學(xué)損傷嚴(yán)重,表明心臟停跳后復(fù)跳可產(chǎn)生心肌缺血再灌注損傷;冠脈流出液中CK-MB活性可反映心肌損傷程度,SF5、SF10組心肌病理學(xué)損傷較對(duì)照組輕,冠脈流出液中CK-MB活性也低于對(duì)照組,表明St.Thomas停跳液中含5%～10%SFI對(duì)心肌缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用。而SF1組心肌病理還損傷與對(duì)照組相似,SF15心肌病理還損傷較對(duì)照組嚴(yán)重,表明St.Thomas停跳液中含15%SFI可加重心肌缺血再灌注損傷。線粒體是對(duì)再灌注損傷異常敏感的細(xì)胞器,其結(jié)構(gòu)或功能異?？稍斐蛇M(jìn)一步的能量代謝障礙、氧自由基生成增加、鈣穩(wěn)態(tài)紊亂,導(dǎo)致惡性循環(huán)。Flameng評(píng)分是對(duì)線粒體形態(tài)學(xué)的綜合評(píng)價(jià),由于半定量指標(biāo)帶有一定主觀性,因此將其結(jié)合線粒體體視學(xué)這一定量指標(biāo)了解線粒體損傷程度更為客觀、可靠。NA增高反映線粒體腫脹變形較輕,δ增高提示心肌組織水腫較輕,線粒體崩解較少。與對(duì)照組比較,本研究中SF5、SF10組NA、δ增高,并且Flameng評(píng)分降低,表明St.Thomas停跳液中含5%～10%SFI對(duì)心肌缺血再灌注后線粒體損傷有較好的保護(hù)作用。缺血再灌注時(shí),線粒體的損傷主要來自氧自由基的攻擊和線粒體鈣超載。MDA是過氧化脂質(zhì)的分解產(chǎn)物,可間接反映氧自由基產(chǎn)生的多少。線粒體MDA含量可作為評(píng)定線粒體受氧自由基攻擊嚴(yán)重程度的指標(biāo)。Ca2+超載是心肌缺血再灌注發(fā)展為不可逆階段的共同途徑,導(dǎo)致細(xì)胞不可逆損傷的根本原因是線粒體Ca2+超載。本研究結(jié)果表明,St.Thomas停跳液中加入5%～10%SFI,能減少心肌缺血再灌注后冠脈流出液中CK-MB活性,降低線粒體MDA含量,減輕線粒體Ca2+超載,但當(dāng)SFI濃度達(dá)到15%時(shí)心肌CK-MB活性增加,線粒體內(nèi)Ca2+負(fù)荷增加,而此時(shí)線粒體MDA含量并未超過對(duì)照組,但高濃度可加重心肌損傷,線粒體Ca2+超載可能是其