淺談滋養(yǎng)因子在不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)發(fā)病中的作用

淺談滋養(yǎng)因子在不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)發(fā)病中的作用

正常流產(chǎn)（ha）是一種常見的病理妊娠，其病因與遺傳因素、內(nèi)在因素、感染因素、內(nèi)生殖器官解剖異常等有關(guān)。但除此之外,仍有60%～70%患者病因不明,臨床上稱之為原因不明習(xí)慣性流產(chǎn)(UnexplainedHA,UHA)。研究認(rèn)為大多數(shù)UHA是由免疫功能異常引起。近年免疫學(xué)領(lǐng)域T輔助細(xì)胞1、2(Th1/Th2)型細(xì)胞因子的發(fā)現(xiàn)及其研究進(jìn)展,為探討UHA的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制開辟了新途徑。學(xué)者們提出妊娠是一種特殊的Th2現(xiàn)象,Th1型細(xì)胞因子過度表達(dá)可致妊娠丟失,Th1/Th2細(xì)胞因子平衡向Th1型細(xì)胞因子偏移與UHA密切相關(guān)。本研究選取IL-2、IFN-γ代表Th1型細(xì)胞因子,IL-4、IL-10代表Th2型細(xì)胞因子,通過檢測(cè)UHA患者外周血及母胎界面各細(xì)胞因子的水平,探討Th1/Th2細(xì)胞因子在UHA發(fā)病中的作用。1材料和方法1.1妊娠合并心臟病放置指征選取1998.10～2000.3在山東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診就診的UHA患者54例,23～41歲,平均(28.8±4.7)歲。35例為有UHA病史,現(xiàn)在未妊娠者,稱為UHA未孕組;19例為有UHA病史,現(xiàn)在確定妊娠并難免流產(chǎn)者,稱為UHA難免流產(chǎn)組。54例UHA患者均經(jīng)過詳細(xì)詢問病史及系統(tǒng)檢查,同時(shí)具備以下條件:①連續(xù)發(fā)生3次或3次以上早期自然流產(chǎn)(3～12次,平均4.1±1.3次),末次發(fā)生于1年以內(nèi);②夫婦雙方染色體檢查正常;③女方生殖道無畸形;④宮頸分泌物檢測(cè)排除生殖道感染;⑤生殖內(nèi)分泌激素測(cè)定及診斷性刮宮排除內(nèi)分泌因素;⑥抗磷脂抗體、抗子宮內(nèi)膜抗體等自身免疫抗體陰性;⑦男方精液常規(guī)檢查正常。另外,19例UHA難免流產(chǎn)者停經(jīng)7+1～11+1周,平均8+4周,B超檢查均探及原始心管搏動(dòng)確診為妊娠并經(jīng)B超動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)胎心搏動(dòng)消失,確診為難免流產(chǎn),標(biāo)本均采集于胎心消失后24小時(shí)內(nèi)。選取15例育齡健康未孕婦女(正常未孕組)及15例正常妊娠行人工流產(chǎn)者(正常妊娠組)作為對(duì)照組,23～40歲,平均27.4±3.1歲,有2次或2次以上妊娠史(包括至少1次足月活產(chǎn)),無自然流產(chǎn)等異常孕育史。15例正常妊娠者停經(jīng)7周～11+1周,停經(jīng)時(shí)間與UHA難免流產(chǎn)組無差異,陰道無急慢性炎癥,無宮內(nèi)節(jié)育器。所有研究組及對(duì)照組于標(biāo)本采集前1個(gè)月內(nèi)均未用過任何藥物。1.2方法1.2.1培養(yǎng)液的制備人妊娠性絨毛膜癌細(xì)胞株Jeg3由Boston生物治療中心LinYX博士惠贈(zèng);含10%胎牛血清及雙抗(青霉素100U/ml,鏈霉素100μg/ml)的RPMI1640培養(yǎng)液(以下簡(jiǎn)稱牛全培)由山東醫(yī)學(xué)科學(xué)院免疫室提供;IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10檢測(cè)試劑盒購自晶美生物公司。1.2.2分離人細(xì)胞,制備jeg-3專利基因用人類妊娠性絨毛膜癌細(xì)胞株Jeg-3制備滋養(yǎng)細(xì)胞抗原。常規(guī)培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)Jeg-3細(xì)胞,至細(xì)胞融合后用0.25%胰酶消化,消化下來的細(xì)胞用無Ca2+、Mg2+的Hanks液洗2次,臺(tái)盼藍(lán)排除法測(cè)細(xì)胞活力>90%后用牛全培調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107ml-1,放入勻漿器中勻漿破壞細(xì)胞,400g轉(zhuǎn)速離心10分鐘,上清液即為富含Jeg-3細(xì)胞膜的滋養(yǎng)細(xì)胞抗原,取上清液用EP管分裝,置-70℃保存?zhèn)溆谩?.2.3細(xì)胞因子誘導(dǎo)誘導(dǎo)藥物誘導(dǎo)活性檢測(cè)UHA未孕組及正常未孕組婦女均于月經(jīng)周期的黃體中期無菌采集肘靜脈血6ml,肝素抗凝,立即按常規(guī)方法用Ficoll-Hypaque分離PBMC,Hanks液洗2次,臺(tái)盼藍(lán)排除法測(cè)細(xì)胞活力>90%,加入牛全培,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106ml-1,按滋養(yǎng)細(xì)胞抗原與PBMC懸液體積比為1∶10的比例將復(fù)溶的滋養(yǎng)細(xì)胞抗原加入PBMC混勻,將細(xì)胞懸液移入24孔平底培養(yǎng)板,每份樣本加2孔,每孔3ml,置37℃5%CO2孵箱中培養(yǎng)。兩組的第1、2、3號(hào)樣本分別于培養(yǎng)12、24、48、72小時(shí)取上清液,UHA組檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間IL-2、IFN-γ的誘生情況,正常對(duì)照組檢測(cè)IL-4、IL-10的誘生情況,以確定各細(xì)胞因子的最佳誘生時(shí)間。其余樣本則根據(jù)測(cè)定的最佳誘生時(shí)間孵育,收集上清液存于-70℃,待測(cè)。1.2.4蛻膜單個(gè)核細(xì)胞的分離UHA難免流產(chǎn)組與正常妊娠組均于人工流產(chǎn)前無菌采集肘靜脈血6ml,肝素抗凝,處理方法同1.2.3,但PBMC懸液中不加滋養(yǎng)細(xì)胞抗原。兩組于人工流產(chǎn)時(shí)無菌刮取蛻膜組織,立即用Hanks液沖洗,去除粘液及血液成分,剪碎至1mm3左右,加入pH值為8的0.25%胰酶,組織與胰酶體積比為1∶3,37℃水浴消化1小時(shí),過100目銅網(wǎng),收集混合單個(gè)細(xì)胞懸液,用Hanks液反復(fù)清洗3次,以Ficoll-Hypaque分離單個(gè)核細(xì)胞,即蛻膜單個(gè)核細(xì)胞(DecidualmononuclearCells,DMC),臺(tái)盼藍(lán)排除法測(cè)細(xì)胞活力>90%后,加入牛全培,調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106ml-1,將細(xì)胞懸液移入24孔平底培養(yǎng)板中,每份樣本加2孔,每孔3ml,置37℃5%CO2孵箱中培養(yǎng),收集上清,-70℃儲(chǔ)存,備測(cè)。1.2.5細(xì)胞因子的測(cè)定采用雙抗體夾心ELISA方法,檢測(cè)所收集上清液中的IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平。操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。1.3統(tǒng)計(jì)處理采用t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1不同誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)il-2、il-4和ifn-的時(shí)間分布滋養(yǎng)細(xì)胞抗原誘生不同細(xì)胞因子的最佳時(shí)間不同,IL-2、IL-4在培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)達(dá)高峰,而IL-10和IFN-γ的最佳誘導(dǎo)時(shí)間在72小時(shí)。2.2不同大小正常未孕組il-2、ifn-及il-10水平比較在最佳誘導(dǎo)時(shí)間下,UHA未孕組PBMC產(chǎn)生IL-2、IFN-γ的水平明顯高于正常未孕組(P均<0.05),而IL-4、IL-10水平明顯低于正常未孕組(P均<0.05),見表1。2.3不同妊娠合并各組il-4、il-10水平比較UHA難免流產(chǎn)組PBMC及DMC產(chǎn)生的IL-2、IFN-γ水平明顯高于正常妊娠組,而IL-4、IL-10水平則明顯低于正常妊娠組,差異均有顯著性(P均<0.05)。兩組PBMC產(chǎn)生的各細(xì)胞因子水平均低于同組DMC,差異有顯著性(P均<0.05),見表2。3討論3.1th1和th2的細(xì)胞因子3.2對(duì)市場(chǎng)化健康的影響我們?cè)谧甜B(yǎng)細(xì)胞抗原刺激UHA未孕組PBMC培養(yǎng)上清液中檢測(cè)到很高的IL-2、IFN-γ水平,而Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-10的含量很低,正常未孕組卻產(chǎn)生高水平的IL-4、IL-10和低水平的IL-2和IFN-γ,說明UHA患者體外對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞抗原產(chǎn)生的免疫應(yīng)答以Th1型免疫反應(yīng)為主,而Th2型免疫應(yīng)答是對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞抗原的正常反應(yīng)。在UHA難免流產(chǎn)組未經(jīng)抗原刺激的PBMC及DMC培養(yǎng)上清液中也檢測(cè)到高水平的Th1型細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ,和低水平的Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-10,與正常妊娠組的檢測(cè)結(jié)果恰恰相反,進(jìn)一步說明體內(nèi)UHA患者血循環(huán)及母胎界面均對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞抗原產(chǎn)生了以Th1型反應(yīng)為主的免疫應(yīng)答,產(chǎn)生大量Th1型細(xì)胞因子。國外有學(xué)者在研究UHA婦女Th細(xì)胞因子的表達(dá)中,也得到了相似的結(jié)論。大量體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí),Th1型細(xì)胞因子具有胚胎毒作用,能妨礙早期胚胎的發(fā)育,引起妊娠丟失。相反Th2型細(xì)胞因子對(duì)正常妊娠的維持起重要作用。可以推測(cè),Th1反應(yīng)與UHA之間存在著必然的聯(lián)系,正是IL-2、IFN-γ等Th1型因子通過某些機(jī)制損害胚胎導(dǎo)致了流產(chǎn)的發(fā)生。或是由于UHA婦女不能產(chǎn)生有效的妊娠保護(hù)性Th2因子以抑制Th1反應(yīng)的緣故。3.3妊娠合并心臟病理血流學(xué)及免疫反應(yīng)Chernoff等已對(duì)人靜脈注射IL-10的安全性進(jìn)行了評(píng)價(jià),為進(jìn)行臨床試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。除了直接注射Th2型細(xì)胞因子治療UHA,還可以用Th1型因子抗體進(jìn)行逆轉(zhuǎn)或進(jìn)行Th2型因子基因治療,這些方法有待進(jìn)一步研究。輔助T細(xì)胞(Thelpercells,Th)根據(jù)其分泌的細(xì)胞因子和功能不同,可分為Th1和Th2細(xì)胞。Th1分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β等,主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫,Th2分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等,主要介導(dǎo)體液免疫。因此,目前許多學(xué)者主張將Th1、Th2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)描述為Th1型免疫反應(yīng)和Th2型免疫反應(yīng),同時(shí)將Th1、Th2細(xì)胞分泌的因子稱為Th1、Th2型細(xì)胞因子。機(jī)體處正常狀態(tài)時(shí),兩型細(xì)胞因子互為抑制,處于動(dòng)態(tài)平衡,維持正常的細(xì)胞免疫和體液免疫功能,一旦這種動(dòng)態(tài)平衡打破,將導(dǎo)致疾病的發(fā)生。近年研究發(fā)現(xiàn),Th1/Th2平衡與妊娠結(jié)局有很大關(guān)系,正常妊娠表現(xiàn)為一種特殊的Th2現(xiàn)象,Th1處于抑制狀態(tài),當(dāng)Th1型細(xì)胞因子過度表達(dá)時(shí),將導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。Th1/Th2型細(xì)胞因子在非妊娠婦女血清中含量極微,難以客觀反映它們的實(shí)際水平,不能體現(xiàn)免疫細(xì)胞的功能狀態(tài),因此目前對(duì)免疫細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-10、IFN-γ等細(xì)胞因子的功能研究一般在體外進(jìn)行。我們模擬正常妊娠的生理過程,用絨癌細(xì)胞株Jeg-3提取滋養(yǎng)細(xì)胞抗原,刺激UHA未孕組及正常未孕組PBMC,用敏感的BA-ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的含量,確定其對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞抗原產(chǎn)生的Th1或Th2型免疫反應(yīng)。Jeg-3細(xì)胞的抗原表型、內(nèi)分泌特征及侵襲性等生物學(xué)行為與人類妊娠早期的滋養(yǎng)細(xì)胞相似,且易純化,去除雜質(zhì)抗原。逆轉(zhuǎn)Th1偏移,治療UHAUHA患者存在Th1型細(xì)胞因子的過度表達(dá),Th1/Th2平衡