抗原刺激誘導(dǎo)的cd4

抗原刺激誘導(dǎo)的cd4

c4-t淋巴結(jié)是一個(gè)調(diào)節(jié)體液和細(xì)胞導(dǎo)管免疫功能的細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞通過(guò)其膜表面的抗原受體識(shí)別由抗原提呈細(xì)胞提供的特異性抗原的刺激信號(hào)(第一信號(hào)),同時(shí)在輔助分子信號(hào)(第二信號(hào))的作用下,CD4+T細(xì)胞開(kāi)始活化、分裂并主要分化成Th1和/或Th2細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞的分化受許多因素的影響,其中最重要的因素就是細(xì)胞因子。IL-12誘導(dǎo)Th1細(xì)胞的分化,而IL-4誘導(dǎo)Th2細(xì)胞的分化。Th1細(xì)胞釋放IFN-γ和LTα,參與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng),而Th2細(xì)胞釋放IL-4、IL-5和IL-10,參與體液介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。為此,與靜止型CD4+T細(xì)胞相比,活化后的CD4+T細(xì)胞不但在膜分子表現(xiàn)型上,而且細(xì)胞內(nèi)基因和細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及生物功能都發(fā)生了明顯改變。為了進(jìn)一步探討抗原特異性CD4+T細(xì)胞的分裂與細(xì)胞膜表型和效應(yīng)功能之間的關(guān)系,本研究觀察TCR-TgCD4+T細(xì)胞,經(jīng)特異性抗原刺激后,檢測(cè)細(xì)胞的分裂與CD25、CD44、CD62L和CD69分子的表達(dá)以及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10產(chǎn)生之間的關(guān)系。1材料和方法1.1材料表面1.1.1實(shí)驗(yàn)大鼠轉(zhuǎn)基因小鼠(DO11、10,TCR-Tg)購(gòu)自Taconic(U.S.A),均為雌性,6~8周齡。1.1.2耐藥抗體和適用基因Per-CP標(biāo)記的抗CD4、APC標(biāo)記抗IFN-γ(APC-IFN-γ)、APC-抗IL-2、APC-抗IL-4、APC-抗IL-10、APC-抗CD25、APC-抗CD44、APC-抗CD62L、APC-抗CD69和APC標(biāo)記的匹配對(duì)照抗體均購(gòu)自美國(guó)BD/PharMingen(Becton.Dickinson/PharMingen)公司。PE標(biāo)記KJ1-26單克隆抗體購(gòu)自CaltagLaboratories(Burlingame,CA)。白細(xì)胞介素(IL)-12購(gòu)自BD/PharMingen。1.2方法1.2.1cd4+t細(xì)胞的分離取小鼠脾和淋巴結(jié),研磨、紗網(wǎng)過(guò)濾,然后經(jīng)Ficoll密度梯度離心(2000r/min,20分鐘),收取單個(gè)核淋巴細(xì)胞。抗原提呈細(xì)胞(APC)的制備:取正常BALB/C小鼠脾細(xì)胞與抗小鼠CD4+、CD8+T細(xì)胞和抗Thy1抗體和補(bǔ)體孵育,去除T細(xì)胞,洗滌2次(1800r/min,10分鐘)后,細(xì)胞懸浮于RPMI1640(含10%胎牛血清)培養(yǎng)液中。經(jīng)γ射線照射(3000rad)后,洗滌細(xì)胞2次,吸棄上清,RPMI1640重懸,計(jì)數(shù)細(xì)胞,作為抗原提呈細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞的分離:取OVAT細(xì)胞受體轉(zhuǎn)基因小鼠的單個(gè)細(xì)胞懸液(TCR-Tg),用PBS+BSA+EDTA緩沖液洗滌2次(1800r/min,10分鐘),按Miltenyi公司說(shuō)明書(shū)敘述的方法加入抗CD4+T細(xì)胞磁珠,分離CD4+T細(xì)胞。經(jīng)由抗TCR-Tg特異性抗體(KJ1-26)染色,流式細(xì)胞儀分析證明>99%的CD4+T細(xì)胞TCR-Tg陽(yáng)性。1.2.2細(xì)胞/ml測(cè)定磁珠分離的CD4+-TCR-Tg細(xì)胞懸浮于磷酸鹽緩沖溶液中,細(xì)胞濃度為10×106細(xì)胞/ml。CFSE(購(gòu)自MolecularProbes公司,Eugene,OR)加入細(xì)胞懸液中,其終濃度為0.25μmol/L,細(xì)胞與CFSE于室溫孵育7分鐘,然后用PBS洗滌3次,并懸浮于RPMI1640培養(yǎng)液中。1.2.3th1細(xì)胞分化CFSE標(biāo)記的TCR-TgCD4+T細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞按1∶6細(xì)胞比例置于6孔培養(yǎng)板中,同時(shí)加入1μg/ml的OVA多肽抗原(OVA323-339)作為刺激組,不加OVA孔為對(duì)照組,而加入OVA抗原同時(shí)加入2ng/ml的IL-12為T(mén)h1細(xì)胞分化組。孵育3天后,收集細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞表面染色。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子產(chǎn)生的檢測(cè),簡(jiǎn)言之,收集的細(xì)胞計(jì)數(shù)后,再與抗原提呈細(xì)胞1∶6混合,加入OVA多肽刺激5小時(shí),刺激的第一個(gè)小時(shí)后,加入Brefeld-A(BFA)(購(gòu)自Sigma)10μg/ml以阻止胞內(nèi)高爾基體介導(dǎo)的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)運(yùn)。1.2.4洗消液反應(yīng)細(xì)胞表面染色按照常規(guī)染色方法進(jìn)行操作。簡(jiǎn)言之,細(xì)胞懸液100μl,加入標(biāo)記的抗細(xì)胞表面特異性抗原的抗體,4℃下避光反應(yīng)30分鐘,洗滌2次(1800r/min,8分鐘)。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的染色,將待測(cè)細(xì)胞用PBS洗滌2次后,加入細(xì)胞固定液,室溫固定7分鐘,洗滌2次,然后加入200μl含有通透劑(Sapomin,Sigma)的牛乳緩沖液作用過(guò)夜,加入特異性的胞內(nèi)標(biāo)記單抗,4℃避光反應(yīng)30分鐘,洗滌2次,300μl染色緩沖液重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。1.2.5tcr-tg抑制劑的檢測(cè)應(yīng)用流式細(xì)胞儀FACSCalibur進(jìn)行檢測(cè)。以CD4和TCR-Tg抗原表面標(biāo)志(KJ1-26)雙標(biāo)記細(xì)胞群開(kāi)窗(gating),以相同種IgG染色為陰性對(duì)照。Cellquest收集細(xì)胞(總數(shù)50000個(gè)細(xì)胞),并分析流式結(jié)果。2結(jié)果2.1ova多肽刺激cfse-標(biāo)記的tcr-tgcd4+t細(xì)胞的分離眾所周知,CD4+T細(xì)胞經(jīng)抗原刺激后,開(kāi)始活化和分裂,在IL-12的作用下,分化為T(mén)h1細(xì)胞。為了進(jìn)一步闡明細(xì)胞分裂的次數(shù)和是否IL-12促進(jìn)細(xì)胞的分裂,我們利用OVA抗原多肽刺激CFSE-標(biāo)記的抗原特異性的TCR-TgCD4+T細(xì)胞,在抗原提呈細(xì)胞存在的情況下,3天后檢測(cè)細(xì)胞的分裂。從圖1可以看出,當(dāng)缺乏OVA多肽時(shí),CD4+T細(xì)胞沒(méi)有任何分裂,可見(jiàn)只有一個(gè)細(xì)胞峰。當(dāng)OVA多肽刺激3天后,大多數(shù)CD4+T細(xì)胞分裂1~5次,而且分裂2~3次的細(xì)胞占大多數(shù)。當(dāng)IL-12加入OVA多肽刺激的細(xì)胞后,IL-12促進(jìn)可細(xì)胞的分裂,可見(jiàn)3~4次分裂的細(xì)胞占大多數(shù)。2.2cd65p分子的表達(dá)為了探討細(xì)胞的分裂和細(xì)胞表面活化分子和粘附分子之間的關(guān)系,我們檢測(cè)抗原特異性CD4+T細(xì)胞在抗原刺激前后細(xì)胞膜表面標(biāo)記的變化。從圖2可以看出,隨著細(xì)胞的分裂,細(xì)胞膜表面分子的表達(dá)有3種類(lèi)型的變化:①CD25和CD44分子在未活化CD4+T細(xì)胞的表達(dá)很低,當(dāng)受到抗原的刺激后,在細(xì)胞分裂之前,CD25和CD44分子的表達(dá)明顯增加,隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加,CD25和CD44分子也隨著增加。②CD62L分子高表達(dá)于未經(jīng)抗原刺激的CD4+T細(xì)胞,隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加,CD62L的表達(dá)逐漸下降。③同樣地,CD69不表達(dá)于未經(jīng)抗原刺激的細(xì)胞,經(jīng)抗原刺激后,CD69在沒(méi)有分裂的細(xì)胞(分裂0細(xì)胞)上的表達(dá)沒(méi)有明顯的增加,但當(dāng)細(xì)胞分裂1次后,幾乎所有的細(xì)胞均表達(dá)CD69,隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加,CD69分子的表達(dá)隨之下降。IL-12對(duì)這些膜分子的表達(dá)未見(jiàn)有明顯影響。2.3抗原刺激對(duì)il-2表達(dá)的影響為了進(jìn)一步探討細(xì)胞分裂與細(xì)胞因子產(chǎn)生之間的關(guān)系,CFSE-標(biāo)記的TCR-TgCD4+T細(xì)胞,在抗原提呈細(xì)胞存在的情況下,利用OVA多肽刺激TCR-TgCD4+T細(xì)胞。3天后,收集細(xì)胞,在抗原提呈細(xì)胞存在的情況下,再一次利用OVA多肽刺激TCR-TgCD4+T細(xì)胞,同時(shí)加入BFA阻止胞內(nèi)細(xì)胞因子釋放,5小時(shí)后收集細(xì)胞、固定、破膜后,進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色。結(jié)果如圖3所示,在初次培養(yǎng)時(shí)未經(jīng)抗原刺激的細(xì)胞,細(xì)胞沒(méi)有分裂,這些細(xì)胞經(jīng)抗原刺激5小時(shí)后,可見(jiàn)37%的細(xì)胞產(chǎn)生IL-2,0.2%的細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ,1%左右的細(xì)胞產(chǎn)生IL-4和0.6%左右的細(xì)胞產(chǎn)生IL-10。在初次培養(yǎng)后,再一次抗原刺激時(shí),IL-2陽(yáng)性的細(xì)胞減少。隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加,IFN-γ、IL-4和IL-10產(chǎn)生的細(xì)胞逐漸增加。IL-12增加IFN-γ產(chǎn)生的陽(yáng)性細(xì)胞,促進(jìn)分裂3~4次細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ,抑制IL-4和IL-10產(chǎn)生細(xì)胞,但對(duì)細(xì)胞的分裂次數(shù)未見(jiàn)有明顯影響。3胞內(nèi)分裂和細(xì)胞細(xì)胞因子的表達(dá)免疫細(xì)胞的活化和增殖是免疫反應(yīng)成功的一種標(biāo)記。CD4+T細(xì)胞對(duì)抗原和致有絲分裂原刺激的反應(yīng)性,表現(xiàn)在細(xì)胞膜表面活化分子和粘附分子的表達(dá)、細(xì)胞的分裂和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。最適應(yīng)的免疫反應(yīng)條件除了需要高濃度的抗原通過(guò)T細(xì)胞抗原受體傳遞激活的信息(第1信號(hào))外,還需要由抗原提呈細(xì)胞通過(guò)共刺激分子所提供的第2信號(hào),這些多種信號(hào)的共同作用促使T細(xì)胞的分裂。經(jīng)過(guò)分裂后,最終分化成為效應(yīng)T細(xì)胞,產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞因子如IFN-γ(Th1)和IL-4(Th2)。目前許多研究均集中于觀察T細(xì)胞的功能和表現(xiàn)型之間的相關(guān)性,但有關(guān)同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的分裂次數(shù)與細(xì)胞表面活化標(biāo)志和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)的報(bào)道甚少。為此,我們探討了當(dāng)抗原特異性CD4+T細(xì)胞經(jīng)抗原刺激后,細(xì)胞的分裂與細(xì)胞表面型和細(xì)胞因子產(chǎn)生之間的關(guān)系。我們的結(jié)果提示,當(dāng)細(xì)胞受到刺激后某些細(xì)胞表面分子表達(dá)的高低和細(xì)胞因子產(chǎn)生的多少與細(xì)胞分裂有著一定的關(guān)系。從圖2可以看出,當(dāng)CD4+T細(xì)胞受到抗原刺激后,在細(xì)胞分裂之前CD25的表達(dá)增加,當(dāng)細(xì)胞第一次分裂以后,CD25的表達(dá)達(dá)到高峰,并維持在較高水平。而CD69分子是在細(xì)胞第一次分裂時(shí)表達(dá)最高,隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加其表達(dá)逐漸減少。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了CD25和CD69分子均是CD4+T細(xì)胞活化的標(biāo)志,但是我們的結(jié)果提示,與CD25分子相比,CD69的表達(dá)與細(xì)胞分裂與否有著更加密切的關(guān)系。細(xì)胞粘附分子CD44和CD62L的表達(dá)也與細(xì)胞的分裂有著密切的關(guān)系,CD44分子隨著細(xì)胞的分裂而增加,但是CD62L隨著細(xì)胞的分裂而減少。為此,觀察CD44和CD62L的表達(dá)的分子密度來(lái)判別初始T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞。這些分子的改變也提示初始T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞在組織器官分布的差異。此外,我們還利用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測(cè)作為CD4+T細(xì)胞效應(yīng)功能的標(biāo)志,在單個(gè)細(xì)胞水平上我們證實(shí)IL-2與細(xì)胞的活化有關(guān),而IFN-γ、IL-4和IL-10與細(xì)胞的分裂有關(guān),隨著細(xì)胞分裂次