銀杏葉提取物銀杏酮酯抗心律失常的藥效及機(jī)制研究

銀杏葉提取物銀杏酮酯抗心律失常的藥效及機(jī)制研究

黃酮類、甘薯、甘草和少量氨基酸。銀杏葉包括黃酮類、甘薯、五味子、堿、長鏈醇、酮和養(yǎng)分。目前國際上常用的銀杏葉提取物為德國Schwabe公司在20世紀(jì)70年代的專利產(chǎn)品EGb761,其中黃酮類的含量為24%,萜內(nèi)酯含量為6%。而我國自主研發(fā)的銀杏酮酯(GBE50)是一種新的銀杏葉標(biāo)準(zhǔn)提取物,其成分為總黃酮44%、總內(nèi)酯6%,因產(chǎn)品工藝的先進(jìn)性,已取得多國專利。GBE50有著廣泛的防治心血管疾病的作用以及臨床運(yùn)用前景,但對(duì)GBE50抗心律失常作用及其機(jī)制的研究未見報(bào)導(dǎo)。心律失常是嚴(yán)重威脅人類健康的心臟疾病,目前藥物治療仍是抗心律失常的主要臨床治療方法。本實(shí)驗(yàn)從整體及細(xì)胞水平采用多種心律失常模型,通過心電記錄分析及心室肌細(xì)胞常規(guī)微電極記錄等方法觀察研究銀杏葉提取物GBE50抗心律失常的作用并進(jìn)一步分析其機(jī)制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1動(dòng)物清潔級(jí)雄性SD大鼠,體重(270±30)g;雄性豚鼠,體重(230±20)g,上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.1.2區(qū)域聚合物的配制含2%丙二醇(PF)生理鹽水溶液;銀杏酮酯母液:每5mg銀杏酮酯溶解于1mL2%丙二醇(PF)溶液中備用,GBE50由杏林藥業(yè)提供(批號(hào)050901);烏頭堿(aconitine,Fluka公司,批號(hào)402350/1)用生理鹽水溶解,配制成50mg·L-1的母液備用,實(shí)驗(yàn)中體積稀釋至3倍使用;哇巴因(ouabain,Sigma公司,批號(hào)057K1625)用生理鹽水溶解,配制成1g·L-1的溶液;奎尼丁(Sigma公司,批號(hào)108F0776)用生理鹽水溶解,配制成1.5625g·L-1的溶液;鹽酸地爾硫卓(日本田邊制藥,批號(hào)0602002)用生理鹽水溶解,配制成234.375mg·L-1的溶液。1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器和儀器RM6240C生物信號(hào)采集系統(tǒng)(成都儀器廠);ZCZ-50自動(dòng)抽注機(jī)(浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器實(shí)驗(yàn)廠);SWF-1W微電極放大器(成都儀器廠);PE-21微電極拉制儀,PF5-1微推進(jìn)器(日本NARISHIGE公司)。1.2方法1.2.1奎尼丁組與gbe50組的刑罰執(zhí)行治療麻醉大鼠用20%烏拉坦按5mL·kg-1腹腔注射,仰臥固定,頸靜脈插管備用。對(duì)照組經(jīng)頸靜脈注射含2%丙二醇(PF)生理鹽水溶液(6.4mL·kg-1);奎尼丁組經(jīng)頸靜脈注射奎尼丁溶液0.01mg·g-1;GBE50組注射不同劑量的GBE50液(8,16,32mg·kg-1)。注射量均為6.4mL·kg-1,2min內(nèi)注射完,穩(wěn)定10min后由頸靜脈通過自動(dòng)抽注機(jī)恒速注入烏頭堿溶液(16.67mg·L-1·min-1),通過RM6240C生物信號(hào)采集系統(tǒng)密切觀察并記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖,并準(zhǔn)確計(jì)算誘發(fā)異常心電(室早、室速、室顫、停搏)的烏頭堿用藥劑量。1.2.2鹽酸地爾硫卓組與gbe50組的配制麻醉大鼠用20%烏拉坦按5mL·kg-1腹腔注射,仰臥固定,頸靜脈插管備用。對(duì)照組經(jīng)頸靜脈注射含2%丙二醇(PF)生理鹽水溶液(6.4mL·kg-1);鹽酸地爾硫卓組經(jīng)頸靜脈注射鹽酸地爾硫卓溶液0.0015mg·g-1;GBE50組注射不同劑量的GBE50液(8,16,32mg·kg-1)。注射劑量均為6.4mL·kg-1,2min內(nèi)注射完,穩(wěn)定10min后由頸靜脈通過自動(dòng)抽注機(jī)恒速注入哇巴因溶液(1000mg·L-1·min-1),通過RM6240C生物信號(hào)采集系統(tǒng)密切觀察并記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖,并準(zhǔn)確計(jì)算誘發(fā)異常心電(室早、室速、室顫、停搏)的哇巴因用藥劑量。1.2.3hz檢測原理將豚鼠擊昏后開胸,迅速取出心臟置于37℃95%O2和5%CO2飽和臺(tái)氏液中,解剖分離出右側(cè)心室乳頭肌用0號(hào)不銹鋼針固定于恒溫[(36±0.5)℃]、恒流(4mL·min-1)的灌流槽中央底部。以鉑金絲電極作細(xì)胞外刺激。用RM6240C型生理實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)輸出電脈沖刺激,刺激波寬1ms、強(qiáng)度為閾值的1.5～2倍,頻率為1.67Hz(BCL=600ms)。以乏極化銀絲作為細(xì)胞外參考電極,記錄電極為玻璃毛細(xì)管(直徑1.5mm,有芯,型號(hào)GG-17,中國科學(xué)院上海生理所產(chǎn)品)經(jīng)微電極拉制儀拉制而成,拉制好的微電極,其內(nèi)充以3mol·L-1KCl的電極內(nèi)液,電極電阻為10～20MΩ,并以鉑金絲電極引導(dǎo),采用標(biāo)準(zhǔn)微電極技術(shù),用微推進(jìn)器將玻璃微電極插入已分離的右心室乳頭肌內(nèi)引出跨膜電位,信號(hào)經(jīng)微電極放大器放大,由RM6240C信號(hào)處理系統(tǒng)顯示、記錄、處理、分析。乳頭肌于正常臺(tái)氏液中持續(xù)灌流2～4h,穩(wěn)定后記錄動(dòng)作電位,待波形穩(wěn)定30min后,改用含有哇巴因的高鈣臺(tái)氏液灌流標(biāo)本30min,觀察DAD及TA出現(xiàn)的時(shí)間及各項(xiàng)指標(biāo)的變化,并以正常臺(tái)氏液洗回以驗(yàn)證相應(yīng)誘發(fā)的DAD和TA的重復(fù)性,以此作為對(duì)照組;維拉帕米組、GBE50高、中、低劑量組:處理同上,待波形穩(wěn)定30min后,分別改用含有維拉帕米(陽性對(duì)照藥)以及不同濃度GBE50的哇巴因、高鈣臺(tái)氏液灌流標(biāo)本30～50min,分別觀察、記錄DAD及TA出現(xiàn)的時(shí)間及各項(xiàng)指標(biāo)的變化,同樣以正常臺(tái)氏液洗回以驗(yàn)證相應(yīng)誘發(fā)的DAD和TA的重復(fù)性。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)用xˉ±sxˉ±s表示,實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)資料均用單因素方差分析以及t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料用精確概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。資料用RM6240C信號(hào)處理軟件、微軟Excel2003及SPSS11.0軟件進(jìn)行原始圖形的采集、數(shù)據(jù)處理、分析及繪圖。2結(jié)果2.1頭皮堿的誘發(fā)對(duì)照組大鼠經(jīng)頸外靜脈給烏頭堿平均劑量達(dá)23.86μg·kg-1時(shí)出現(xiàn)室性早搏(VP),劑量達(dá)27.21μg·kg-1時(shí)發(fā)生室速(VT),劑量達(dá)34.71μg·kg-1時(shí)誘發(fā)室顫(VF),當(dāng)劑量增加至43.40μg·kg-1時(shí)則導(dǎo)致心跳停搏(CA)?？岫〗M(Quin)則使烏頭堿誘發(fā)的室早、室速、室顫、停搏劑量分別提高至29.55,34.52,39.15,48.68μg·kg-1,誘發(fā)的室早、室速劑量與對(duì)照組比較具有顯著性差異(P<0.05)。8mg·kg-1GBE50使烏頭堿誘發(fā)室速劑量提高至32.62μg·kg-1;16mg·kg-1GBE50使烏頭堿誘發(fā)的室顫、停搏劑量分別提高至48.62,57.43μg·kg-1;32mg·kg-1GBE50使烏頭堿誘發(fā)的室早、室速劑量分別提高至28.06,31.30μg·kg-1,上述數(shù)值和對(duì)照組比較有明顯的升高并具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01,表1)。結(jié)果表明GBE50具有抗烏頭堿所致心律失常的作用。2.2兩組課外療效比較對(duì)照組大鼠經(jīng)頸外靜脈給哇巴因平均劑量達(dá)534.49μg·kg-1時(shí)出現(xiàn)室性早搏,劑量達(dá)1056.50μg·kg-1時(shí)發(fā)生室速,劑量達(dá)1579.18μg·kg-1時(shí)誘發(fā)室顫,當(dāng)劑量增加至1891.09μg·kg-1時(shí)則導(dǎo)致心跳停搏。地爾硫卓組(DIL)則使哇巴因誘發(fā)的室早、室速、室顫、停搏劑量分別提高至845.24,1341,2099,2404μg·kg-1,與對(duì)照組比較具有明顯的升高并具有顯著性差異(P<0.01或P<0.05)。8,16mg·kg-1GBE50使哇巴因誘發(fā)的室早劑量分別提高至755.28,751.72μg·kg-1;16mg·kg-1GBE50使哇巴因誘發(fā)的室速劑量提高至1291μg·kg-1,上述數(shù)值和對(duì)照組比較具有顯著性差異(P<0.05);16mg·kg-1GBE50組與地爾硫卓組比較具有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)果顯示8,16mg·kg-1銀杏酮酯GBE50可明顯提高哇巴因所致大鼠心律失常實(shí)驗(yàn)中哇巴因誘發(fā)的室早、室速、室顫、停搏劑量,但作用較地爾硫卓要弱,而32mg·kg-1GBE50則沒有明顯的預(yù)防作用,表明了GBE50抗心律失常作用在一定濃度范圍內(nèi)有效(表2)。2.3灌流標(biāo)本獲得的反演分析應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)微電極技術(shù)在臺(tái)氏液中記錄到豚鼠心室乳肌頭動(dòng)作電位(AP),穩(wěn)定30min,改用含有哇巴因(2μmol·L-1)的高鈣(CaCl25.4mmol·L-1)臺(tái)氏液灌流標(biāo)本,經(jīng)12.37min左右開始出現(xiàn)DAD,連續(xù)灌流30min可以誘發(fā)乳頭肌產(chǎn)生波形典型、重復(fù)性好的DAD,并可以觀察到連續(xù)性的或非連續(xù)性的TA,其發(fā)生率為87.5%。同時(shí)動(dòng)作電位波形開始明顯改變,表現(xiàn)為RP除極,APA減小,APD縮短,平臺(tái)期消失。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GBE50可以明顯抑制哇巴因、高鈣誘發(fā)的DAD和TA,并呈一定的濃度依賴性(表3,圖1)。3實(shí)踐機(jī)制之一:ca2+與銀杏酮酯的相互作用烏頭堿致心律失常的機(jī)制是通過激活心肌細(xì)胞的快Na+通道,使Na+通道開放,加速心肌細(xì)胞Na+內(nèi)流,促使細(xì)胞膜去極化,加速起搏點(diǎn)的自律性。還能夠提高心房傳導(dǎo)組織和房室束-浦肯野系統(tǒng)等快反應(yīng)細(xì)胞的自律性,從而形成一源性或多源性異位節(jié)律,縮短心肌不應(yīng)期,導(dǎo)致心律失常。哇巴因是復(fù)制心律失常模型經(jīng)典工具藥。哇巴因能與Na+-K+-ATP酶結(jié)合并抑制心肌細(xì)胞膜上的Na+-K+-ATP酶,從而減少K+向細(xì)胞內(nèi)的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn),這樣就導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na+高K+低,靜息膜電位(RMP)增高,心室自律性提高,傳導(dǎo)減慢,在浦肯野纖維與心室肌結(jié)合部位引起單向傳導(dǎo)阻滯而引起折返;另外細(xì)胞內(nèi)高Na+,可通過Na+/Ca2+交換機(jī)制使細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加,導(dǎo)致振蕩性后電位而引起異位節(jié)律,誘發(fā)快速型心律失常。還有研究表明哇巴因誘發(fā)心律失常與縮短動(dòng)作電位時(shí)程(APD)有關(guān),而且實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Ito(瞬時(shí)外向鉀電流)和IK1均參與了縮短APD的過程,是心律失常的發(fā)生機(jī)制之一。尚有報(bào)道哇巴因的心臟毒性作用與自由基損傷等有關(guān),哇巴因誘發(fā)心律失常的機(jī)制是多樣的,細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載只是其中之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GBE50對(duì)烏頭堿及哇巴因致整體動(dòng)物心律失常模型有著顯著性抑制心律失常的作用。作者還從細(xì)胞水平探索GBE50抗心律失常的作用。Cranefield從基本電生理學(xué)出發(fā)把異常起搏活動(dòng)分為兩大類:一類是早期后除極,另一類是延遲后除級(jí)。延遲后除極DAD是在心肌動(dòng)作電位完全復(fù)極化后發(fā)生的跨膜電位的震蕩。跨膜電位震蕩達(dá)到一定閾值就產(chǎn)生自發(fā)反應(yīng),被稱為觸發(fā)活動(dòng)(triggeredactivity,TA)。目前普遍認(rèn)為DAD誘發(fā)的TA可能是某些臨床心律失常發(fā)生的重要機(jī)制。在離體組織上,DAD和DAD誘發(fā)的TA常常在細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯提高或細(xì)胞內(nèi)鈣超載的情況下出現(xiàn)。哇巴因的應(yīng)用和細(xì)胞外高鈣最終引起細(xì)胞內(nèi)高鈣,就可以激活,而使更多的Ca2+離子從肌漿網(wǎng)中釋放出來,最終觸發(fā)DAD。從DAD發(fā)生的離子機(jī)制上來講,DAD是被Iti即短暫內(nèi)向離子流誘導(dǎo)產(chǎn)生的。如果應(yīng)用藥物抑制Iti就可以抑制DAD的發(fā)生。Iti的組成包括一種非選擇性陽離子流和一種生電性Na-Ca交換介導(dǎo)的離子流。二者都是繼發(fā)于Ca2+離子從超載的肌漿網(wǎng)中釋放的。在實(shí)驗(yàn)中觀察到銀杏酮酯可以減少DAD的幅度和持續(xù)間期以及TA的發(fā)生率。銀杏酮酯對(duì)DAD和TA的這種