銀杏葉提取物銀杏酮酯抗心律失常的藥效及機制研究

銀杏葉提取物銀杏酮酯抗心律失常的藥效及機制研究

黃酮類、甘薯、甘草和少量氨基酸。銀杏葉包括黃酮類、甘薯、五味子、堿、長鏈醇、酮和養(yǎng)分。目前國際上常用的銀杏葉提取物為德國Schwabe公司在20世紀70年代的專利產(chǎn)品EGb761,其中黃酮類的含量為24%,萜內(nèi)酯含量為6%。而我國自主研發(fā)的銀杏酮酯(GBE50)是一種新的銀杏葉標準提取物,其成分為總黃酮44%、總內(nèi)酯6%,因產(chǎn)品工藝的先進性,已取得多國專利。GBE50有著廣泛的防治心血管疾病的作用以及臨床運用前景,但對GBE50抗心律失常作用及其機制的研究未見報導。心律失常是嚴重威脅人類健康的心臟疾病,目前藥物治療仍是抗心律失常的主要臨床治療方法。本實驗從整體及細胞水平采用多種心律失常模型,通過心電記錄分析及心室肌細胞常規(guī)微電極記錄等方法觀察研究銀杏葉提取物GBE50抗心律失常的作用并進一步分析其機制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1動物清潔級雄性SD大鼠,體重(270±30)g;雄性豚鼠,體重(230±20)g,上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。1.1.2區(qū)域聚合物的配制含2%丙二醇(PF)生理鹽水溶液;銀杏酮酯母液:每5mg銀杏酮酯溶解于1mL2%丙二醇(PF)溶液中備用,GBE50由杏林藥業(yè)提供(批號050901);烏頭堿(aconitine,Fluka公司,批號402350/1)用生理鹽水溶解,配制成50mg·L-1的母液備用,實驗中體積稀釋至3倍使用;哇巴因(ouabain,Sigma公司,批號057K1625)用生理鹽水溶解,配制成1g·L-1的溶液;奎尼丁(Sigma公司,批號108F0776)用生理鹽水溶解,配制成1.5625g·L-1的溶液;鹽酸地爾硫卓(日本田邊制藥,批號0602002)用生理鹽水溶解,配制成234.375mg·L-1的溶液。1.1.3實驗儀器和儀器RM6240C生物信號采集系統(tǒng)(成都儀器廠);ZCZ-50自動抽注機(浙江醫(yī)科大學醫(yī)學儀器實驗廠);SWF-1W微電極放大器(成都儀器廠);PE-21微電極拉制儀,PF5-1微推進器(日本NARISHIGE公司)。1.2方法1.2.1奎尼丁組與gbe50組的刑罰執(zhí)行治療麻醉大鼠用20%烏拉坦按5mL·kg-1腹腔注射,仰臥固定,頸靜脈插管備用。對照組經(jīng)頸靜脈注射含2%丙二醇(PF)生理鹽水溶液(6.4mL·kg-1);奎尼丁組經(jīng)頸靜脈注射奎尼丁溶液0.01mg·g-1;GBE50組注射不同劑量的GBE50液(8,16,32mg·kg-1)。注射量均為6.4mL·kg-1,2min內(nèi)注射完,穩(wěn)定10min后由頸靜脈通過自動抽注機恒速注入烏頭堿溶液(16.67mg·L-1·min-1),通過RM6240C生物信號采集系統(tǒng)密切觀察并記錄Ⅱ導聯(lián)心電圖,并準確計算誘發(fā)異常心電(室早、室速、室顫、停搏)的烏頭堿用藥劑量。1.2.2鹽酸地爾硫卓組與gbe50組的配制麻醉大鼠用20%烏拉坦按5mL·kg-1腹腔注射,仰臥固定,頸靜脈插管備用。對照組經(jīng)頸靜脈注射含2%丙二醇(PF)生理鹽水溶液(6.4mL·kg-1);鹽酸地爾硫卓組經(jīng)頸靜脈注射鹽酸地爾硫卓溶液0.0015mg·g-1;GBE50組注射不同劑量的GBE50液(8,16,32mg·kg-1)。注射劑量均為6.4mL·kg-1,2min內(nèi)注射完,穩(wěn)定10min后由頸靜脈通過自動抽注機恒速注入哇巴因溶液(1000mg·L-1·min-1),通過RM6240C生物信號采集系統(tǒng)密切觀察并記錄Ⅱ導聯(lián)心電圖,并準確計算誘發(fā)異常心電(室早、室速、室顫、停搏)的哇巴因用藥劑量。1.2.3hz檢測原理將豚鼠擊昏后開胸,迅速取出心臟置于37℃95%O2和5%CO2飽和臺氏液中,解剖分離出右側心室乳頭肌用0號不銹鋼針固定于恒溫[(36±0.5)℃]、恒流(4mL·min-1)的灌流槽中央底部。以鉑金絲電極作細胞外刺激。用RM6240C型生理實驗系統(tǒng)輸出電脈沖刺激,刺激波寬1ms、強度為閾值的1.5～2倍,頻率為1.67Hz(BCL=600ms)。以乏極化銀絲作為細胞外參考電極,記錄電極為玻璃毛細管(直徑1.5mm,有芯,型號GG-17,中國科學院上海生理所產(chǎn)品)經(jīng)微電極拉制儀拉制而成,拉制好的微電極,其內(nèi)充以3mol·L-1KCl的電極內(nèi)液,電極電阻為10～20MΩ,并以鉑金絲電極引導,采用標準微電極技術,用微推進器將玻璃微電極插入已分離的右心室乳頭肌內(nèi)引出跨膜電位,信號經(jīng)微電極放大器放大,由RM6240C信號處理系統(tǒng)顯示、記錄、處理、分析。乳頭肌于正常臺氏液中持續(xù)灌流2～4h,穩(wěn)定后記錄動作電位,待波形穩(wěn)定30min后,改用含有哇巴因的高鈣臺氏液灌流標本30min,觀察DAD及TA出現(xiàn)的時間及各項指標的變化,并以正常臺氏液洗回以驗證相應誘發(fā)的DAD和TA的重復性,以此作為對照組;維拉帕米組、GBE50高、中、低劑量組:處理同上,待波形穩(wěn)定30min后,分別改用含有維拉帕米(陽性對照藥)以及不同濃度GBE50的哇巴因、高鈣臺氏液灌流標本30～50min,分別觀察、記錄DAD及TA出現(xiàn)的時間及各項指標的變化,同樣以正常臺氏液洗回以驗證相應誘發(fā)的DAD和TA的重復性。1.3統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)用xˉ±sxˉ±s表示,實驗計數(shù)資料均用單因素方差分析以及t檢驗進行統(tǒng)計學分析,計量資料用精確概率法進行統(tǒng)計分析。資料用RM6240C信號處理軟件、微軟Excel2003及SPSS11.0軟件進行原始圖形的采集、數(shù)據(jù)處理、分析及繪圖。2結果2.1頭皮堿的誘發(fā)對照組大鼠經(jīng)頸外靜脈給烏頭堿平均劑量達23.86μg·kg-1時出現(xiàn)室性早搏(VP),劑量達27.21μg·kg-1時發(fā)生室速(VT),劑量達34.71μg·kg-1時誘發(fā)室顫(VF),當劑量增加至43.40μg·kg-1時則導致心跳停搏(CA)?？岫〗M(Quin)則使烏頭堿誘發(fā)的室早、室速、室顫、停搏劑量分別提高至29.55,34.52,39.15,48.68μg·kg-1,誘發(fā)的室早、室速劑量與對照組比較具有顯著性差異(P<0.05)。8mg·kg-1GBE50使烏頭堿誘發(fā)室速劑量提高至32.62μg·kg-1;16mg·kg-1GBE50使烏頭堿誘發(fā)的室顫、停搏劑量分別提高至48.62,57.43μg·kg-1;32mg·kg-1GBE50使烏頭堿誘發(fā)的室早、室速劑量分別提高至28.06,31.30μg·kg-1,上述數(shù)值和對照組比較有明顯的升高并具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01,表1)。結果表明GBE50具有抗烏頭堿所致心律失常的作用。2.2兩組課外療效比較對照組大鼠經(jīng)頸外靜脈給哇巴因平均劑量達534.49μg·kg-1時出現(xiàn)室性早搏,劑量達1056.50μg·kg-1時發(fā)生室速,劑量達1579.18μg·kg-1時誘發(fā)室顫,當劑量增加至1891.09μg·kg-1時則導致心跳停搏。地爾硫卓組(DIL)則使哇巴因誘發(fā)的室早、室速、室顫、停搏劑量分別提高至845.24,1341,2099,2404μg·kg-1,與對照組比較具有明顯的升高并具有顯著性差異(P<0.01或P<0.05)。8,16mg·kg-1GBE50使哇巴因誘發(fā)的室早劑量分別提高至755.28,751.72μg·kg-1;16mg·kg-1GBE50使哇巴因誘發(fā)的室速劑量提高至1291μg·kg-1,上述數(shù)值和對照組比較具有顯著性差異(P<0.05);16mg·kg-1GBE50組與地爾硫卓組比較具有顯著性差異(P<0.05)。結果顯示8,16mg·kg-1銀杏酮酯GBE50可明顯提高哇巴因所致大鼠心律失常實驗中哇巴因誘發(fā)的室早、室速、室顫、停搏劑量,但作用較地爾硫卓要弱,而32mg·kg-1GBE50則沒有明顯的預防作用,表明了GBE50抗心律失常作用在一定濃度范圍內(nèi)有效(表2)。2.3灌流標本獲得的反演分析應用標準微電極技術在臺氏液中記錄到豚鼠心室乳肌頭動作電位(AP),穩(wěn)定30min,改用含有哇巴因(2μmol·L-1)的高鈣(CaCl25.4mmol·L-1)臺氏液灌流標本,經(jīng)12.37min左右開始出現(xiàn)DAD,連續(xù)灌流30min可以誘發(fā)乳頭肌產(chǎn)生波形典型、重復性好的DAD,并可以觀察到連續(xù)性的或非連續(xù)性的TA,其發(fā)生率為87.5%。同時動作電位波形開始明顯改變,表現(xiàn)為RP除極,APA減小,APD縮短,平臺期消失。實驗結果顯示GBE50可以明顯抑制哇巴因、高鈣誘發(fā)的DAD和TA,并呈一定的濃度依賴性(表3,圖1)。3實踐機制之一:ca2+與銀杏酮酯的相互作用烏頭堿致心律失常的機制是通過激活心肌細胞的快Na+通道,使Na+通道開放,加速心肌細胞Na+內(nèi)流,促使細胞膜去極化,加速起搏點的自律性。還能夠提高心房傳導組織和房室束-浦肯野系統(tǒng)等快反應細胞的自律性,從而形成一源性或多源性異位節(jié)律,縮短心肌不應期,導致心律失常。哇巴因是復制心律失常模型經(jīng)典工具藥。哇巴因能與Na+-K+-ATP酶結合并抑制心肌細胞膜上的Na+-K+-ATP酶,從而減少K+向細胞內(nèi)的主動轉運,這樣就導致細胞內(nèi)Na+高K+低,靜息膜電位(RMP)增高,心室自律性提高,傳導減慢,在浦肯野纖維與心室肌結合部位引起單向傳導阻滯而引起折返;另外細胞內(nèi)高Na+,可通過Na+/Ca2+交換機制使細胞內(nèi)Ca2+增加,導致振蕩性后電位而引起異位節(jié)律,誘發(fā)快速型心律失常。還有研究表明哇巴因誘發(fā)心律失常與縮短動作電位時程(APD)有關,而且實驗證實了Ito(瞬時外向鉀電流)和IK1均參與了縮短APD的過程,是心律失常的發(fā)生機制之一。尚有報道哇巴因的心臟毒性作用與自由基損傷等有關,哇巴因誘發(fā)心律失常的機制是多樣的,細胞內(nèi)Ca2+超載只是其中之一。本實驗結果表明GBE50對烏頭堿及哇巴因致整體動物心律失常模型有著顯著性抑制心律失常的作用。作者還從細胞水平探索GBE50抗心律失常的作用。Cranefield從基本電生理學出發(fā)把異常起搏活動分為兩大類:一類是早期后除極,另一類是延遲后除級。延遲后除極DAD是在心肌動作電位完全復極化后發(fā)生的跨膜電位的震蕩?？缒る娢徽鹗庍_到一定閾值就產(chǎn)生自發(fā)反應,被稱為觸發(fā)活動(triggeredactivity,TA)。目前普遍認為DAD誘發(fā)的TA可能是某些臨床心律失常發(fā)生的重要機制。在離體組織上,DAD和DAD誘發(fā)的TA常常在細胞內(nèi)Ca2+濃度明顯提高或細胞內(nèi)鈣超載的情況下出現(xiàn)。哇巴因的應用和細胞外高鈣最終引起細胞內(nèi)高鈣,就可以激活,而使更多的Ca2+離子從肌漿網(wǎng)中釋放出來,最終觸發(fā)DAD。從DAD發(fā)生的離子機制上來講,DAD是被Iti即短暫內(nèi)向離子流誘導產(chǎn)生的。如果應用藥物抑制Iti就可以抑制DAD的發(fā)生。Iti的組成包括一種非選擇性陽離子流和一種生電性Na-Ca交換介導的離子流。二者都是繼發(fā)于Ca2+離子從超載的肌漿網(wǎng)中釋放的。在實驗中觀察到銀杏酮酯可以減少DAD的幅度和持續(xù)間期以及TA的發(fā)生率。銀杏酮酯對DAD和TA的這種