微生物方法驗證報告

報告審核同意:ReportReview/ApprovalSignatures報告審核/同意簽字Date日期Draftedby/起草人Reviewedby/審核人Approvedby/同意人目錄目的……………..………………...3介紹與匯總……………………….3樣品、儀器、培養(yǎng)基及稀釋液………………….4細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)辦法的驗證………….4控制菌檢查辦法驗證……………..6總結(jié)………………...7偏差………………...7附錄A:****膠囊(規(guī)格10mg)微生物程度檢查辦法….……..8目的通過對生產(chǎn)工藝和輔料發(fā)生變更后的***膠囊(規(guī)格10mg)微生物程度檢查的驗證，確認(rèn)所采用的辦法適合于該藥品的微生物程度的測定,以證明所設(shè)定的檢查條件及檢查程序?qū)赡艽嬖诘母黝愇⑸餆o克制作用，確保檢查成果的真實性和重現(xiàn)性。介紹與總匯***膠囊(規(guī)格10mg)微生物程度檢查中計數(shù)辦法驗證細(xì)菌、霉菌及酵母菌采用平皿法（1ml/皿）；控制菌檢查辦法驗證采用常規(guī)法（10ml供試液加入到100mlBL培養(yǎng)基中）。為證明此辦法能消除***膠囊(規(guī)格10mg)的抑菌活性及測定辦法的可靠性，QC按照方案（文獻(xiàn)編號：VP9023-01）對微生物程度檢查辦法進(jìn)行驗證。辦法驗證內(nèi)容涉及：細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)辦法驗證、控制菌檢查辦法驗證。驗證成果證明：該檢查辦法和檢查條件能消除***膠囊(規(guī)格10mg)的抑菌活性，符合微生物程度檢查辦法驗證規(guī)定。日常檢測按驗證的辦法和條件進(jìn)行微生物程度檢查。計數(shù)辦法驗證及控制菌辦法驗證成果匯總見下表：驗證時間樣品批號規(guī)格驗證成果計數(shù)辦法驗證（菌回收率%）控制菌驗證大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉菌-10-26070110mg87.795.5113.789.0115.7實驗組檢出實驗菌，供試品組、陰性對照呈陰性，無抑菌活性。-10-26070210mg87.789.2104.890.692.1實驗組檢出實驗菌，供試品組、陰性對照呈陰性，無抑菌活性。-10-26070310mg101.977.8111.692.896.1實驗組檢出實驗菌，供試品組、陰性對照呈陰性，無抑菌活性。辦法驗證成果匯總樣品、儀器、培養(yǎng)基及稀釋樣品***膠囊規(guī)格：10mg批號：0701、0702、0703儀器儀器名稱型號編號生產(chǎn)廠家生化培養(yǎng)箱LRH-250FA0054上海一恒科技有限公司霉菌培養(yǎng)箱MJ-250-ⅡA0052上海一恒科技有限公司培養(yǎng)基名稱干粉批號生產(chǎn)廠家營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基0210北京奧博星生物科技有限公司玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基0210北京奧博星生物科技有限公司營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基0406北京奧博星生物科技有限公司改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基101028北京三藥生物科技有限公司膽鹽乳糖培養(yǎng)基0115北京奧博星生物科技有限公司4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基091029北京三藥生物科技有限公司培養(yǎng)基稀釋液PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.9%無菌氯化鈉溶液含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)辦法的驗證菌種菌種菌種序列號代次菌種來源大腸埃希菌CMCC（B）44102第3代四川省藥品檢檢所金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003第5代四川省藥品檢檢所枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501第3代四川省藥品檢檢所白色念珠菌CMCC（F）98001第5代四川省藥品檢檢所黑曲霉菌CMCC（F）98003第5代四川省藥品檢檢所菌液制備及同時計數(shù)將制備好的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌菌懸液用0.9％無菌氯化鈉溶液做10倍系列稀釋制成每1ml含菌數(shù)50～100CFU的工作菌液；黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫，并做10倍系列稀釋制成每1ml含孢子數(shù)50～100CFU的孢子菌液。取工作菌液1ml用平皿法做活菌計數(shù)。計數(shù)成果見下表：菌種成果（CFU/ml）平均值（CFU/ml）稀釋級皿1皿2大腸埃希菌10-6757977金黃色葡萄球菌10-6827679枯草芽孢桿菌10-6697773白色念珠菌10-5899290.5黑曲霉菌10-5676063.5供試品制備：稱取***膠囊(規(guī)格10mg)5g，加PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至50ml，45℃水浴10分鐘，取出混勻，即為1：10供試液。根據(jù)驗證方案（文獻(xiàn)編號：VP9023-01）規(guī)定對***膠囊(規(guī)格10mg)計數(shù)辦法驗證，細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)辦法驗證采用平皿法（1ml/皿），3次獨立實驗中，各實驗菌的回收率成果見下表：驗證起止時間樣品批號菌種成果菌液組實驗組回收率（%）供試品組陰性對照組-10-26～-10-310701大腸埃希菌7767.587.700金黃色葡萄球菌7975.595.5枯草芽孢桿菌7383113.7白色念珠菌90.580.589.000黑曲霉菌63.573.5115.7驗證起止時間樣品批號菌種成果菌液組實驗組回收率（%）供試品組陰性對照組-10-26～-10-310702大腸埃希菌7767.587.700金黃色葡萄球菌7970.589.2枯草芽孢桿菌7376.5104.8白色念珠菌90.58290.600黑曲霉菌63.558.292.1-10-26～-10-310703大腸埃希菌7778.5101.900金黃色葡萄球菌7961.577.8枯草芽孢桿菌7381.5111.6白色念珠菌90.58492.800黑曲霉菌63.56196.1計數(shù)辦法驗證明驗結(jié)論：通過采用平皿法（1ml/皿）對3批樣品進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)辦法驗證，實驗成果表明：供試品組檢查合格、陰性對照組無菌生長、實驗組各菌的回收率均高于70%，無抑菌活性，符累計數(shù)辦法驗證的規(guī)定。故可按此檢查辦法和條件對***膠囊(規(guī)格10mg)進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌檢查?？刂凭鷻z查辦法驗證菌種菌種菌種序列號代次菌種來源大腸埃希菌CMCC（B）44102第3代四川省藥品檢檢所菌液制備及計數(shù)見計數(shù)辦法驗證中的菌液制備及計數(shù)成果見4.2。根據(jù)驗證方案（文獻(xiàn)編號：VP9023-01）規(guī)定對***膠囊(規(guī)格10mg)采用常規(guī)法對控制菌檢查辦法進(jìn)行實驗（10ml加入到100ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中），3次獨立實驗中，實驗組、供試品組及陰性對照組驗證成果以下表：驗證起止時間樣品批號項目成果實驗組供試品組陰性對照組-10-26～-10-280701MUG培養(yǎng)基＋－－靛基質(zhì)試劑＋－－-10-26～-10-280702MUG培養(yǎng)基＋－－靛基質(zhì)試劑＋－－-10-26～-10-280703MUG培養(yǎng)基＋－－靛基質(zhì)試劑＋－－控制菌檢查辦法實驗結(jié)論：在3次獨立實驗中，控制菌檢查辦法驗證采用常規(guī)法（10ml供試液加入到100mlBL培養(yǎng)基中）進(jìn)行實驗，實驗成果表明：實驗組檢出實驗菌，供試品組、陰性對照組呈陰性，無抑菌活性，符合控制菌驗證規(guī)定。故可按此檢查辦法和條件對***膠囊(規(guī)格10mg)進(jìn)行控制菌檢查?？偨Y(jié)通過對3批樣品驗證，細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)驗證采用平皿法（1ml/皿），控制菌檢查驗證采用常規(guī)法（10ml供試液加入到100mlBL培養(yǎng)基中），實驗成果表明：計數(shù)辦法驗證各實驗菌的回收率均高于70%，控制菌檢查實驗組檢出實驗菌，供試品組、陰性對照組呈陰性，無抑菌活性，符合微生物程度檢查驗證規(guī)定，日常檢測按此檢查辦法和條件進(jìn)行微生物程度檢查。偏差無附錄A***膠囊(規(guī)格10mg)微生物程度檢查辦法細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)培養(yǎng)基及試液營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液供試液制備稱取供試品5g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至50ml，45℃水浴10分鐘，取出混勻，即為1：10的供試液。操作取1：10的供試液各1ml至Ф90mm的培養(yǎng)皿中，然后加入15ml～20ml已融化好并冷卻至約45℃的適宜培養(yǎng)基。細(xì)菌數(shù)用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，霉菌及酵母菌數(shù)用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基平行制備2皿。培養(yǎng)倒置培養(yǎng)，細(xì)菌的培養(yǎng)溫度為30℃～35℃，培養(yǎng)3天。霉菌及酵母菌的培養(yǎng)溫度為23℃～28℃大腸埃希菌檢查培養(yǎng)基及試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基（MUG）麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacC）或曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(EMB)0.9%無菌氯化鈉溶液操作取膽鹽乳糖培養(yǎng)基3瓶，每瓶100ml。1瓶加入供試液10ml（供試液制備見1.2），混勻；1瓶加入供試液10ml及含菌數(shù)為10CFU～100CFU大腸埃希菌的工作菌液，混勻，做為陽性對照；另1瓶加入稀釋劑10ml做為陰性對照，混勻。30℃～35℃培養(yǎng)18～24小時。必要時可延長至取上述培養(yǎng)物0.2ml，接種至含5mlMUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，30℃～35℃培養(yǎng)，于5小時、24小時在366nm紫外線下觀察，同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照觀察。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽性；不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性