《目基因克隆》課件

《目基因克隆》PPT課件基因克隆是一項(xiàng)重要而又復(fù)雜的技術(shù)，它對(duì)于生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有著巨大的推動(dòng)作用。什么是基因克隆基因克隆可以從一個(gè)細(xì)胞中制造出與原始細(xì)胞相同的復(fù)制品。這項(xiàng)技術(shù)在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用和推廣前景?；蚩寺〉臍v史11972保羅·伯格和斯坦利·科恩最早提出基因克隆的概念。21977謝里頓和琳恩·恩澤爾開發(fā)了第一種基因克隆技術(shù)——DNA限制酶消化和連接技術(shù)。31982安德魯·弗朗西斯和ColinWard發(fā)明了篩選克隆細(xì)胞的新方法——藍(lán)白斑篩選法。41986美國最高法院頒布《巴波納法案》限制了對(duì)基因克隆的使用與發(fā)展。目的基因克隆的意義實(shí)現(xiàn)基因的快速擴(kuò)增可用于高效制備目標(biāo)基因，并作為其他基礎(chǔ)研究和應(yīng)用開發(fā)的基礎(chǔ)。生成轉(zhuǎn)基因模型動(dòng)物可通過轉(zhuǎn)基因模型動(dòng)物對(duì)人類及動(dòng)物重要性狀進(jìn)行研究，如遺傳病的研究等。基因治療和藥物生產(chǎn)可供有關(guān)基因治療和藥物開發(fā)的基礎(chǔ)研究及應(yīng)用。產(chǎn)生基因工程菌和植物可用于從分子層面上研究如何調(diào)節(jié)生物、生產(chǎn)藥物等，對(duì)人類健康和社會(huì)發(fā)展有巨大的貢獻(xiàn)。目標(biāo)基因的選擇功能描述優(yōu)質(zhì)基因與目標(biāo)產(chǎn)物有密切關(guān)聯(lián)、或其編碼產(chǎn)物具有重要的生物活性。選擇位點(diǎn)可以很好地控制轉(zhuǎn)基因生物的外顯或內(nèi)源性表達(dá)?？刹僮餍苑磻?yīng)體系中該基因擴(kuò)增、連接、篩選等能否獲得高效并具有可重復(fù)性。安全性不會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境和醫(yī)療應(yīng)用產(chǎn)生未知的風(fēng)險(xiǎn)和潛在的負(fù)面影響。PCR技術(shù)PCR技術(shù)是基因克隆技術(shù)中非常重要的一種技術(shù)手段，其作用是對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR技術(shù)的應(yīng)用范圍很廣，從基礎(chǔ)研究到應(yīng)用開發(fā)都有廣泛的應(yīng)用?；蚩寺〉膸追N常用方法1限制酶糖基化及反應(yīng)體系目的基因的擴(kuò)增方法及適用反應(yīng)體系2重組DNA技術(shù)獲得目的基因的拼接方法及操作步驟3核酸雜交和PCR基因篩選的方法及其在擴(kuò)增、純化及表達(dá)中應(yīng)用的局限性和改進(jìn)措施。4基因組破碎及分離目的基因的篩選與克隆方法及其在生物質(zhì)能源及生物醫(yī)學(xué)工程中的應(yīng)用案例。質(zhì)粒載體的選擇和構(gòu)建選擇質(zhì)粒應(yīng)能有效攜帶、繁殖、表達(dá)目標(biāo)DNA序列，并且能夠在特定細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生將基因表達(dá)出來的蛋白質(zhì)。構(gòu)建可通過化學(xué)合成大片段或以重組技術(shù)獲取人工合成的DNA，然后純化與載體的DNA共同連接，建立帶有目標(biāo)基因的質(zhì)粒載體。限制酶的選擇和作用限制酶的切割位置特異性有助于拆分DNA測序、DNA雜交、擴(kuò)增、連接等操作?？赏ㄟ^PCR生成的片段被限制酶切割后能夠組合成新的質(zhì)粒載體構(gòu)建方法，加快了目標(biāo)基因的篩選速度。DNA連接的方法1平端連接法使用聚合酶和T4DNA連接酶粘合兩端，然后使用接頭連接法。適用于一段向量和一段目標(biāo)外源DNA。常在大規(guī)模連接完成后使用限制酶切割。2T4DNA連接法使用T4酶粘合向量端和外源DNA的末端，然后采用聚合酶方法將兩端連接在一起。3接頭連接法特殊的寡核苷酸可以在虛擬的限制酶切位點(diǎn)上加入。也可以在反演端加入。適用于臂長相差較大或有靠近的限制酶切割位點(diǎn)的情況。細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法1電轉(zhuǎn)化法通過利用高溫和某些化學(xué)物質(zhì)，使目標(biāo)細(xì)胞膜通透性提高，增加外來表達(dá)載體引入的可能性。2鈣磷共轉(zhuǎn)法通過載體末端與正離子綁定，使其靠近細(xì)胞膜并將載體引導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞中。3病毒載體法病毒侵入細(xì)胞的方式，使質(zhì)?；蚧蛳到y(tǒng)轉(zhuǎn)入目標(biāo)細(xì)胞的方法。篩選重組細(xì)胞的方法藍(lán)白斑篩選法可根據(jù)轉(zhuǎn)化后細(xì)菌在藍(lán)白斑培養(yǎng)板上的表現(xiàn)不同來篩選重組細(xì)胞。熒光篩選法在表達(dá)向量中加入熒光編碼序列，在目標(biāo)基因穩(wěn)定表達(dá)后，可以通過上機(jī)檢測目標(biāo)細(xì)胞特異性熒光進(jìn)一步篩選重組細(xì)胞?？股睾Y選法利用抗生素與載體抗性之間的聯(lián)系，通過外源基因?qū)D(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行篩選，從而得到目標(biāo)重組細(xì)胞。獲得目標(biāo)基因的方法PCR-ELISA法使用PCR技術(shù)制作的片段模板可以通過ELISA法得到目標(biāo)基因。RNA法通過RNAprobe直接檢測RNA轉(zhuǎn)錄物以獲得目標(biāo)基因。融合體將外源基因與表達(dá)載體融合，產(chǎn)生大量的融合蛋白輸出，從而得到目標(biāo)基因。同源重組法通過外源基因的同源片段與放大后的目的片段交叉重組，得到目標(biāo)基因?；蚩寺〉膽?yīng)用可用于強(qiáng)化藥物的活性及特異性，促進(jìn)藥物的研發(fā)和制備?？捎糜陂_發(fā)新的轉(zhuǎn)基因資源以提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力?？捎糜谶M(jìn)行基因治療以緩解或治愈一些人類罕見遺傳病?；蚩寺〉木窒扌?倫理風(fēng)險(xiǎn)問題基因克隆技術(shù)肆意使用可能造成的不可逆轉(zhuǎn)的誤用和危害；2法律政策問題關(guān)于基因克隆安全監(jiān)管相關(guān)法律缺乏明朗清晰的界定和保障；3技術(shù)瓶頸問題基因克隆技術(shù)存在操作手段等多方面技術(shù)瓶頸問題，對(duì)進(jìn)一步推廣普及該技術(shù)和應(yīng)用造成阻礙。?；蚬こ痰陌l(fā)展趨勢德爾菲技術(shù)的興起基因編輯技術(shù)的開發(fā)，有可能實(shí)現(xiàn)精確地對(duì)基因進(jìn)行修改以最終達(dá)到預(yù)期效果。合成生物學(xué)的興起利用化學(xué)合成的生物分子，設(shè)計(jì)、構(gòu)造、重構(gòu)和調(diào)節(jié)具有開創(chuàng)性的生物系統(tǒng)、合成部件和分子機(jī)制?；蚩寺≡卺t(yī)療和生物產(chǎn)業(yè)中的推廣前景1改進(jìn)技術(shù)縮短周期不斷更新推陳出新，將推動(dòng)該技術(shù)的技術(shù)更新和更新應(yīng)用的發(fā)展。2新技術(shù)讓基因克隆變得更安全、更方便、更有效醫(yī)療和生物產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展將有一個(gè)更達(dá)標(biāo)、更系統(tǒng)和更合理的規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)體系。3結(jié)構(gòu)和功能的智能匹配成為新的技術(shù)發(fā)展目標(biāo)生物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展將更好地應(yīng)用于廣泛的產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域，實(shí)現(xiàn)技術(shù)推廣和普惠性增強(qiáng)?；蚩寺〉陌踩珕栴}外源DNA對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生影響外源DNA的引入將改變宿主細(xì)胞內(nèi)某些基因的表達(dá)情況，對(duì)細(xì)胞有一定的影響?；蚩寺〉臐撛陲L(fēng)險(xiǎn)病毒編碼的熒光蛋白，使肺癌細(xì)胞體內(nèi)和外部能夠被控制，在為環(huán)境或精度提供反饋的同時(shí)，對(duì)生命安全也有著不可撼動(dòng)的影響。生物體本質(zhì)缺陷基因克隆實(shí)驗(yàn)也有可能進(jìn)一步擴(kuò)大動(dòng)植物生命的基因缺陷風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響生物生存及其未來發(fā)展前景?；蚩寺〉牡赖聠栴}基因技術(shù)并非像其他技術(shù)一樣無中性，具有不同的社會(huì)和道德問題，例如在醫(yī)學(xué)倫理和動(dòng)物福利等方面存在著巨大的爭議。對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品加工中的基因克隆問題，也存在一些道德難題，如農(nóng)作物質(zhì)量安全和動(dòng)物生存福利等問題?；蚩寺〉奈磥戆l(fā)展方向個(gè)體化醫(yī)療的需求基因克