hiv-1gp60長基因序列及感染特征研究

hiv-1gp60長基因序列及感染特征研究

感染i型感染的i型糖蛋白（env）是中和抗體的主要靶點(diǎn)。其中，表面糖蛋白100g120包含cd4和t淋巴結(jié)（cd4細(xì)胞）的結(jié)合區(qū)域，以及穿過膜蛋白gg41的泛在體中。它是掃描t細(xì)胞的重要蛋白質(zhì)，最終決定掃描t細(xì)胞的選擇嗜性。研究顯示,不同亞型的HIV-1病毒株在急性感染期其Env蛋白的可變區(qū)長短、N-糖基化位點(diǎn)數(shù)、對中和抗體的敏感性方面均有差異。Env的結(jié)構(gòu)、功能特性可在一定程度上決定HIV-1的傳播,并可能由此影響疫苗的設(shè)計。因此,獲得HIV-1各基因亞型急性期Env蛋白結(jié)構(gòu)、生物學(xué)信息和免疫活性知識,構(gòu)建急性期Env-HIV-1假病毒,將有助于揭示HIV-1傳播株侵入人體的病毒學(xué)特征,同時有助于設(shè)計更好的免疫原,為最終設(shè)計出能誘導(dǎo)HIV-1廣譜中和抗體疫苗做出貢獻(xiàn)。HIV-1(歐美)B亞型毒株主要在北京市男男性行為人群(Menwhohavesexwithmen,MSM)中流行,是該人群中發(fā)現(xiàn)最早的HIV-1流行亞型。本研究從前期北京市MSM隊列篩查發(fā)現(xiàn)的一例HIV-1B亞型急性期感染者中,擴(kuò)增出gp160全長基因,分析了生物學(xué)特性,并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了假病毒,初步驗(yàn)證其具有很強(qiáng)的感染活性。1對象和方法1.1hiv-1急性感染來自北京佑安醫(yī)院感染中心MSM隨訪隊列。對HIV陰性的MSM定期隨訪,檢測HIV-1核糖核酸(Ribonucleicacid,RNA)和HIV抗體,以發(fā)現(xiàn)HIV急性感染者。本文的研究對象在第4次隨訪時,發(fā)現(xiàn)其HIV-1RNA陽性,而HIV抗體陰性,隨后每周隨訪一次,HIV抗體反應(yīng)逐漸增強(qiáng),直到蛋白免疫印跡法(WesternBlotting,WB)檢測呈陽性,證實(shí)其為HIV-1急性感染者。本研究已通過本單位倫理委員會審查并獲得研究對象的知情同意。1.2env-pcd-na3.1和gp141)gp160全長基因擴(kuò)增與真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建:采用Qiagen的離心柱式RNA提取試劑盒進(jìn)行HIVRNA提取,采用invitrogen公司的互補(bǔ)脫氧核糖核酸(Complementarydeoxyribonucieicacid,cDNA)合成試劑盒進(jìn)行第一鏈cDNA合成。gp160全長擴(kuò)增引物序列如下:env-up:5′-TACAGTGC-AGGGGAAAGAATAATAGACATAATA-3′,envlo:5′-AGACCCAGTACAGGCRARAAGC-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物片段約4.7千堿基(Kilobase,kb);巢式聚合酶鏈反應(yīng)(Nestedpolymerasechainreaction,nPCR)內(nèi)側(cè)引物序列:B-TOPO:5′-CACCTAGGCATCTCCTAT-GGCAGGAAGAAG-3′,ENV-I:5′-GTTTCTTCC-AGTCCCCCCTTTTCTTTTAAAAAG-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物長度約3.1kb。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后,直接與pcDNA3.1/V5-His-TOPO(Invitrogen)真核表達(dá)載體連接。經(jīng)克隆篩選后,測序驗(yàn)證是否為插入方向正確的Env-pcDNA3.1真核表達(dá)克隆。2)gp160全長基因測序:按照擴(kuò)增引物測序后得到的序列信息,再設(shè)計新的測序引物,直至將所擴(kuò)增得到的gp160全長基因測通,用contig2.0軟件拼接序列后,得到gp160全長核苷酸和氨基酸序列信息。序列比對的參考株如下:B亞型:HXB2、SF162(歐美B亞型代表株),BJOX003000.19.1、BJOX022000.02.3(北京MSM人群感染株,分別處于FeibigⅡ期和Ⅳ期),DEMB09CN002(分離自中國慢性感染期MSM感染人群,地區(qū)不詳)和HQ215556(來自石家莊MSM人群感染株,處于慢性期感染期);B′型:RL42;CRF01-AE型:CM240;CRF07-BC重組型:CN54。用Mega5.0的neighborjoiningmethod構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。4)假病毒包裝及感染活性測定:將env-pcD-NA3.1真核表達(dá)質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒pNL4-3.Luc.R-E-(本實(shí)驗(yàn)室保存)以1∶3比例(總量5μg)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,轉(zhuǎn)染試劑為PEI(購自北京博邁德生物公司),轉(zhuǎn)染前2小時更換無血清培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染后4小時更換為完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清、90%DMEM,均購自Hyclone生物公司),48小時后收獲病毒;同時設(shè)pNL4-3.Luc.R-E-骨架質(zhì)粒對照和pVSVG(水泡性口炎病毒包膜,本實(shí)驗(yàn)室保存)對照。將制備的假病毒感染ghost(CCR5/CXCR4雙嗜性)細(xì)胞,具體操作如下:ghost細(xì)胞以1×104/孔接種于96孔板,每孔加病毒上清20μL,培養(yǎng)基250μL,感染48小時后,棄掉上清,用pH7.0的PBS漂洗細(xì)胞一遍,之后加入20μL細(xì)胞裂解液(購自Promega公司),取20μL裂解上清加入100mLluciferase報告基因檢測試劑(購自Promega公司),在發(fā)光儀上讀取luciferase數(shù)值,測試孔數(shù)值大于空白對照孔3倍以上則判為(relativeluciferaseunit,RLU)陽性。2結(jié)果2.1hiv-1抗體檢測結(jié)果對該隨訪患者的血漿樣本進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)HIV-1病毒載量達(dá)6log,而HIV抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-likedimmunosorbentassay,ELISA)檢測結(jié)果為陰性,WB檢測亦無條帶。兩周后隨訪,HIV抗體ELISA呈陽性反應(yīng),WB檢測結(jié)果為不確定(出現(xiàn)p24、gp160條帶),4周后隨訪,WB檢測出現(xiàn)p24、gp160、gp41、gp120帶,確證為HIV-1抗體陽性。依據(jù)Feibig分期標(biāo)準(zhǔn),此患者屬于HIV-1急性期感染的FeibigI期。將該患者編號為patient-7(表1)。2.2gp14真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建取該患者處于FeibigI期(HIV-1RNA陽性而HIV抗體陰性)時點(diǎn)的血漿標(biāo)本,提取RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄、巢式PCR擴(kuò)增,得到一條約為3.1kb的PCR產(chǎn)物(圖1),經(jīng)切膠回收后,用于全長env基因序列測定,另將PCR產(chǎn)物直接與pcDNA3.1His/V5Top10表達(dá)載體直接相連,進(jìn)行g(shù)p160真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。2.3rl42基因差異度系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明,patient-7標(biāo)本的env全長與B亞型參考株SF162、HXB2和B′亞型代表株RL42聚集在一起,基因差異度分別為13.16%、14.57%和14.92%,與同是分離自中國MSM的四個B亞型代表株親緣關(guān)系更近,其中與北京市MSM分離株BJOX02-2000.02.3的基因差異度最小,為8.31%(圖2)。2.4謝-1gp160氨基酸序列特征分析2.4.1patint-7氨基酸序列及突變序列分析結(jié)果顯示,patient-7gp160全長有852個氨基酸,與其他國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)株長度相似。對可變區(qū)V1~V5的氨基酸序列分析顯示,V1、V2氨基酸長度較其他急、慢性感染期毒株均較長,但規(guī)律不明顯;V3環(huán)為較為保守的35個氨基酸,與北京分離株相近;與上述幾個標(biāo)準(zhǔn)株相比,patient-7氨基酸變異主要集中在V1~V5區(qū);序列比對顯示,氨基酸序列與處于FeibigⅣ期的BJOX022000.02.3更為接近(表2、圖2)。2.4.2gp21糖基化位點(diǎn)patient-7gp160糖基化位點(diǎn)總數(shù)31個,與分別處于FeibigⅡ期和FeibigⅣ期的BJOX003000.19.1和BJOX022000.02.3相同,三者gp120和gp41糖基化程度相同;與HXB2的N-糖基化位點(diǎn)總數(shù)相同,但比HXB2gp120糖基化位點(diǎn)多2個,相反gp41糖基化較HXB2低;與同處于慢性感染期的兩個參考株N-糖基化位點(diǎn)各自與patient-7差異各不同(表2)。2.4.3wgr基序V3環(huán)頂端四肽序列是較為少見的GWGR基序,并非歐美B亞型常見的GPGR基序,與BJOX022000.02.3的V3頂端四肽相同。2.4.4中和抗體3f5和4e十年mper的蛋白表達(dá)gp41近膜端(membraneproximalexternalregion,MPER)存在著中和抗體2F5和4E10識別的保守表位,分別為ELDKWA和NWFDIT基序。氨基酸序列分析顯示,patient-7樣本gp41MPER區(qū)上述兩個中和抗體識別表位均未發(fā)生變異(圖3)。2.4.5主受體表型預(yù)測利用Geno2pheno軟件進(jìn)行輔助受體表型預(yù)測結(jié)果顯示,gp120V3環(huán)為CCR5嗜性。2.5pvs-1-env假病毒的檢測將包裝的假病毒感染ghost細(xì)胞,48小時后測定RLU發(fā)光值,env-pcDNA3.1+pNL4-3.Luc.R-E-樣品孔RLU發(fā)光值達(dá)到7.8×107,pVSVG+pNL4-3.Luc.R-E-孔RLU達(dá)到6×106,空白對照孔和骨架質(zhì)粒pNL4-3.Luc.R-E-RLU分別為300、350,證實(shí)包裝的HIV-1-Env假病毒具有很強(qiáng)的感染活性。3b亞型b亞型檢測病毒傳播目前世界上絕大多數(shù)HIV經(jīng)性途徑傳播,在經(jīng)性傳播的過程中,能突破傳播“瓶頸”的毒株成為最終的傳播毒株,即為感染的“奠基病毒”(foundervirus)。研究證實(shí),76%感染者的“奠基病毒”為1個病毒,只有24%的感染者可能受到2~5個病毒的初始感染。原則上,這些“奠基病毒”應(yīng)該是中和抗體的主要靶標(biāo),且是驗(yàn)證疫苗是否有效的最適參考株。因而,感染急性期HIV的生物學(xué)特性最接近“奠基病毒”,對這個時期病毒特征的研究可為揭示HIV的傳播特性、研發(fā)能產(chǎn)生廣譜中和抗體的HIV疫苗提供重要的生物學(xué)信息。Env的結(jié)構(gòu)、功能可能決定HIV-1的傳播特性。有報道經(jīng)異性性接觸傳播的A亞型和C亞型病毒傳播株,其gp160具截短、可變區(qū)結(jié)構(gòu)壓縮、N-糖基化位點(diǎn)減少以及對感染源血清抗體中和敏感的特點(diǎn)。本研究對分離自北京市MSM人群中的一例處于FeibigI期B亞型HIV-1感染者血漿中g(shù)p160進(jìn)行了全長基因擴(kuò)增和序列分析。氨基酸序列分析表明,該例處于FeibigI期的急性期感染患者env全長無明顯的截短,與同亞型內(nèi)處于FeibigⅡ期和FeibigⅣ期的參考株特征更為相似,僅其V1、V2區(qū)長度較其他急、慢性參考株長,其余三個可變區(qū)氨基酸長短變化并無規(guī)律。從N-糖基化程度來說,patient-7與BJOX003000.19.1和BJOX022000.02.3參考株gp120和gp41糖基化位點(diǎn)數(shù)均相同。分析原因,可能與上述兩個參考株均分離自北京市的MSM,傳染源相近有關(guān)?？傮w來說,該例急性期感染株gp160全長氨基酸與急、慢性參考株在氨基酸生物學(xué)信息未見明顯差異。本研究結(jié)果與國外報道的關(guān)于B亞型急性期感染病毒傳播株特征相似。但仍需擴(kuò)大樣本量以及進(jìn)一步做中和試驗(yàn)來驗(yàn)證病毒的生物學(xué)特性。歐美B亞型在世界范圍內(nèi)流行廣泛,其中一個顯著特征是V3環(huán)頂端存在一個“GPGR”四肽基序。但有諸多報道顯示,此四肽基序會發(fā)生基因和抗原性變異。其中最常見的變異是第2個氨基酸由脯氨酸變?yōu)樯彼?從而形成“GWGR”基序。有臨床研究顯示,V3環(huán)頂端四肽“GWGR”基序的HIV-1感染者較GPGR基序感染者的疾病進(jìn)展慢。本研究發(fā)現(xiàn),patient-7與BJOX022000.02.3V3環(huán)頂端四肽均為較為少見的“GWGR”基序。結(jié)合以往對于中國其他省市同性戀人群HIV流行亞型的報道,發(fā)現(xiàn)GWGR基序在我國B亞型毒株中較為常見。其臨床意義需要進(jìn)一步探討。本研究進(jìn)一步對patient-7gp41近膜端區(qū)廣譜中和抗體4E10和2F5表位的氨基酸進(jìn)行分析,此兩個中和抗體作用表位并未發(fā)生變異,理論上來說,該傳播毒株應(yīng)該