猴免疫缺陷病毒siv糧食源性細胞癌株在中國淮河猴動物模型上的急性期變化

猴免疫缺陷病毒siv糧食源性細胞癌株在中國淮河猴動物模型上的急性期變化

aid是由身體感染的人類免疫缺陷（害蟲）引起的全身神經(jīng)系統(tǒng)損傷引起的共病。恒河猴在基因序列、血液生化指標等方面與人相近,感染猴免疫缺陷病毒(simianimmunode-ficiencyvirus,SIV)后發(fā)病機理、過程、臨床癥狀表現(xiàn)與人艾滋病相似,可在感染病毒后出現(xiàn)免疫體系的損害和多系統(tǒng)多器官組織的病變,所以猴艾滋病模型成為艾滋病研究的一個金標準,并為WHO所推薦。國外恒河猴猴艾滋病模型多采用印度恒河猴。中國恒河猴應用于艾滋病模型在國內(nèi)雖然較為常見,但對感染急性期模型的研究結果報道較少,而且并不詳細,這對中國恒河猴應用于艾滋病模型研究的標準化建立帶來了急性期研究內(nèi)容的缺失。本研究針對SIVmac239感染中國恒河猴急性期10周內(nèi)各監(jiān)測指標進行了研究,具體結果報道如下。1材料和方法1.1動物和環(huán)境1.1.1年齡2.7歲研究對象為15只中國恒河猴,雄性,體質(zhì)量4.5～6.5kg,3～5歲,平均年齡為(3.91±0.67)歲。外觀健康,體檢無淺表淋巴結腫大,經(jīng)檢測結核菌素試驗陰性和胸部X光片正常,痢疾菌陰性,血清學SIV、猴逆轉錄D病毒(SRV)、猴B病毒(BV)、猴T淋巴細胞I型病毒(STLV-I)抗體陰性,購自廣東省靈長類動物實驗中心,合格證號:SCXK粵2009-0025。1.1.2實驗動物及飼養(yǎng)本研究在廣東省靈長類動物實驗中心進行,實驗場地為生物安全2級實驗室,動物實驗設施檢驗編號:NO.C2009022。動物單籠飼養(yǎng)在不銹鋼籠具中,每天投3次飼料,自由飲水。室溫20℃～25℃,相對濕度50%～70%。1.1.3實驗過程規(guī)范本實驗經(jīng)廣東省靈長類動物實驗中心動物倫理委員會批準(文件編號:K09004-IACUC),實驗嚴格按照廣東省靈長類動物實驗中心標準操作/作業(yè)流程執(zhí)行,并按照K09004-IACUC文件中內(nèi)容給予相應的動物福利。1.2sivrna檢測檢測用熒光標記單克隆抗體CD3-別藻藍蛋白(APC)、CD4-異硫氰酸熒光素(FITC)、CD8-藻紅蛋白(PE)均購自美國BD公司;SIVRNA抽提采用自制一管式體液病毒核酸抽提試劑;逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、探針法熒光定量PCR試劑盒均購自立陶宛Fermentas公司;ABI-7300PCR儀(美國生物系統(tǒng)公司);ABXPENTRA60全自動血細胞分析儀(法國HoribaABX公司);FACSCalibur型流式細胞儀(美國BD公司)。1.3動物的感染試驗模型復制參照文獻進行。SIVmac239病毒株由中國科學院昆明動物研究所鄭永唐博士饋贈,廣州中醫(yī)藥大學熱帶醫(yī)學研究所保存。病毒滴度為5.0×105組織半數(shù)感染量(TCID50)/mL,動物以氯胺酮7mg/kg麻醉后,以5MID100(100%感染劑量)經(jīng)靜脈注射1mL感染動物。感染后2周,以血漿病毒分離陽性證實病毒感染模型復制成功。1.4感染情況檢測挑選檢疫合格的健康中國恒河猴,靜脈接種SIVmac239病毒株復制中國恒河猴艾滋病模型。檢測感染0d、3d、7d、10d、14d、17d、21d、24d、28d、6周、10周模型猴血常規(guī)及病毒載量變化;檢測感染0d、14d、28d、6周、10周模型猴T淋巴細胞亞群變化情況;記錄感染后每天臨床癥狀變化情況及每周體質(zhì)量指數(shù)(bodymassindex,IBM)變化情況。1.5觀察指標根據(jù)試驗方案對以下指標試驗時點進行監(jiān)測。1.5.1糞尿、林毛、毛采食觀察:食欲是否正常,有無挑食、拒食現(xiàn)象,是否有啃籠具、吃糞便現(xiàn)象。精神狀態(tài):有無萎靡不振、垂頭抱腹、躺臥等現(xiàn)象;有無精神狂躁、抽搐、運動失調(diào)、四肢癱瘓等癥狀。糞尿情況:觀察糞便的顏色、形狀、氣味、排糞次數(shù)、含水量、糞便數(shù)量,糞便是否為膿血便、水樣便、黏液便、帶有腐味的稀糊狀糞便。觀察排尿次數(shù)、每次排尿量及顏色等。同時觀察有無嘔吐、口渴、腹脹、脫肛等。皮膚被毛:有無咬傷、創(chuàng)傷、被毛蓬亂、被毛缺損或脫毛等;有無水皰、丘疹、脫水皺縮,四肢關節(jié)有無腫脹等現(xiàn)象。1.5.2體重指數(shù)根據(jù)參考文獻及前期研究基礎,計算IBM=mbody/l2冠臀冠臀2。1.5.3光定量pcr法檢測病毒載量于8:00AM采集空腹16h恒河猴靜脈抗凝血4mL,采用全自動血細胞分析儀分析血常規(guī):白細胞(WBC)、淋巴細胞(LYM)、中性粒細胞(NEU);采用流式細胞儀分析T淋巴細胞亞群;熒光定量PCR法測病毒載量,以100μL血漿中提取的RNA為模板經(jīng)逆轉錄后,采用ABI-7300PCR儀測定,定量PCR探針序列為:FAM-TGCGTAACACCCGAACCAGGAATCTCAGC-TAMRA,引物序列為:上游引物CTTGGACTGA-CATTTAGCGTAGC;下游引物GCCACATGCTTT-CATTTAAGTACG。反應條件為:95℃、10min預變性,然后以95℃、15s,60℃、1min進行45個循環(huán),采用定量PCR儀自帶軟件分析,檢測病毒載量[n(copies/mL)],以logn值表示。1.6統(tǒng)計學處理方法數(shù)據(jù)分析用SPSS17.0統(tǒng)計軟件,計量資料用均數(shù)±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,不同時間點指標比較采用配對T檢驗。校驗水準α=0.05。2結果2.1中國恒恒猴繁育模式在急性感染階段的體質(zhì)量和體重指數(shù)發(fā)生了變化表1結果顯示:中國恒河猴艾滋病模型急性感染期10周內(nèi)體質(zhì)量及體質(zhì)量指數(shù)比較穩(wěn)定,各時間點比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。2.2病毒載量發(fā)生下降表2結果表明:WBC、LYM%、NEU%在感染10周內(nèi)出現(xiàn)水平波動。病毒載量在第10～14天達到高峰,隨后病毒載量出現(xiàn)波動下降趨勢,在感染第10周下降至均數(shù)最低水平。淋巴細胞百分比與病毒載量對數(shù)值變化較為一致。2.3不同/周感染時間感染2周、10周、0周圖1、表3結果顯示:感染2～10周,CD3、CD4、CD8計數(shù),CD3%、CD8%均不同程度升高,其中,感染2周、10周與0周比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);CD4%、CD4/CD8值均不同程度降低,其中CD4%感染10周與0周比較,CD4/CD8值感染2周、10周與0周比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。2.4腹瀉臨床癥狀臨床癥狀觀察發(fā)現(xiàn)15只中國恒河猴艾滋病模型在急性感染期4周內(nèi),有6只恒河猴未觀察到明顯臨床癥狀,其余9只急性感染期4周內(nèi)合計252(9只×4周×7次)次共觀察到腹瀉癥狀21次,攝食減少14次。單猴臨床癥狀出現(xiàn)最多為9次,最少為1次。其中腹瀉癥狀最早出現(xiàn)在感染第5天,共有2只恒河猴同時出現(xiàn)該癥狀;攝食減少最早出現(xiàn)在感染第11天,共有2只恒河猴同時出現(xiàn)該癥狀;其中腹瀉臨床癥狀最嚴重表現(xiàn)為便中帶血及黏液。攝食減少臨床癥狀最嚴重表現(xiàn)為攝食量0。感染6～10周內(nèi)臨床癥狀基本消失或僅偶而出現(xiàn)輕微的臨床癥狀,持續(xù)時間較短。3病毒感染時hiv的變化艾滋病長期感染后可導致多種臨床癥狀如食欲下降、體質(zhì)量減輕、腹瀉、各種機會性感染等,但在病毒感染急性期上述癥狀臨床上一般不會出現(xiàn)。本研究采用艾滋病中國恒河猴動物模型對艾滋病急性期感染進行研究,研究結果顯示:在急性感染期10周內(nèi)體質(zhì)量及體質(zhì)量指數(shù)比較穩(wěn)定,與艾滋病期出現(xiàn)的消耗綜合癥體質(zhì)量及體質(zhì)量指數(shù)顯著下降有明顯的區(qū)別。急性期的臨床癥狀主要表現(xiàn)為腹瀉和體檢淋巴結增大,出現(xiàn)的幾率、持續(xù)時間和癥狀的輕重也與艾滋病期不完全相同,具有本期的特點。本研究動物模型感染SIVmac239病毒后,病毒載量迅速上升,在感染第10～14天達到高峰,隨后出現(xiàn)波動下降趨勢,在感染第10周下降至均數(shù)最低水平。整個過程具有明顯的病毒高峰期,約在10周左右進入病毒平臺期。HIV的主要受體是T細胞表面的CD4分子,其疾病進展的總特點是人體血液中CD4+T淋巴細胞的數(shù)量逐漸減少以及病毒血癥的增加。CD8+T淋巴細胞是機體抗HIV最主要的免疫細胞,在HIV感染初期,隨著病毒量的增加,CD8+淋巴細胞的數(shù)量也隨之上升,CD4、CD8T淋巴細胞的數(shù)量對于確定HIV感染狀況、是否進入發(fā)病期、判斷HIV感染者的臨床合并癥、確定抗HIV藥物治療的時機及機會性感染的預防和治療均具有極其重要的作用。本研究中病毒感染2周后T淋巴細胞亞群出現(xiàn)顯著改變,其中CD3%、CD3計數(shù)兩指標出現(xiàn)上升趨勢,可能為急性感染期內(nèi)機體免疫功能應對病毒感染所導致。CD4%與CD4計數(shù)變化并不同步,感染后CD4%呈下降趨勢,但CD4計數(shù)卻出現(xiàn)增加趨勢,推測是由于病毒炎癥的刺激致CD4計數(shù)應激性增加。此時期CD8計數(shù)也呈現(xiàn)增加趨勢,推測可能是CD8計數(shù)增加的幅度大于CD4增加幅度致CD4%下降,這種急性期變化與艾滋病晚期CD4大量耗竭變化方式不一樣。由此,本課題組推測急性期CD4計數(shù)實質(zhì)性增加可能為病毒感染更多細胞和病毒進入潛伏階段提供了基礎;CD8%、CD8計數(shù)兩指標出現(xiàn)上升趨勢可能為急性感染期內(nèi)機體免疫功能應對病毒感染所引起。CD4/CD8比值是反映細胞免疫平衡狀態(tài)的敏感性指標,該比值的變化被認為是觀察疾病嚴重度和預后的重要指標之一。本研究中感染后在病毒載量高峰期時CD4/CD8出現(xiàn)最低值,然后隨著病毒載量下降而出現(xiàn)明顯上升趨勢,表現(xiàn)出艾滋病感染的特性。通過對CD3%及其計數(shù),CD4%、CD8%及其計數(shù)綜合分析,認為急性感染期10周CD3變化引起因素中CD8比重較CD4更大,變化意義有待進一