組織脫水過程中脫脂方法的研究

組織脫水過程中脫脂辦法的研究Thestudyofhowtoremovefatduringtissuedehydration丁偉1#，周立新2#，唐巍2，應(yīng)李雄1，姚洪田1，張淼2，唐蒙蒙1，張晟2摘要：在病理常規(guī)解決中富含脂肪的組織經(jīng)常會出現(xiàn)脫水、透明不佳，造成制片不全、質(zhì)量較差，切片困難等現(xiàn)象。乙醇和二甲苯被認為在組織解決環(huán)節(jié)起到脫水及透明的作用，但在傳統(tǒng)流程中的實際效果往往不佳。我們通過把傳統(tǒng)脫水、透明流程中使用的無水乙醇、二甲苯液改為無水乙醇、二甲苯液等量混合液進行脫水、脫脂、透明，獲得了令人滿意的效果。核心詞：組織解決、脫脂、無水乙醇、二甲苯、無水乙醇二甲苯混合液病理組織制備環(huán)節(jié)中脂肪的解決始終是比較困難的事情，在傳統(tǒng)觀念中認為高濃度酒精含有一定的脫脂作用。當(dāng)解決含有大量脂肪組織的時候建議延長高濃度乙醇的解決時間，以期得到好的成果，但最后往往不能令人滿意。二甲苯始終被認為是一種媒介試劑，二甲苯既能與乙醇混合，又能溶解石蠟，因此在其間起到置換乙醇，接引石蠟的媒介作用，在這一過程中組織塊內(nèi)的乙醇最后被二甲苯所取代。我們通過對乙醇和二甲苯在組織脫水、脫脂中作用的研究，并在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院和北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院2個單位同時進行實驗認證，采用無水乙醇與二甲苯1：1混合的方式進行組織解決，運用乙醇與二甲苯協(xié)同作用，脫水、脫脂共同進行，得到了滿意的成果，現(xiàn)介紹以下。1.材料和辦法：1.1試劑和設(shè)備：75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、二甲苯，達科為全封閉脫水機，櫻花全封閉脫水機，克拉泰切片機，徠卡2235切片機。1.2材料：通過提取的豬油；不同部位的手術(shù)標(biāo)本組織；脫水機內(nèi)通過試劑及沉淀物?；痦椖浚嚎萍疾繑?shù)字診療裝備研發(fā)課題（YFC0114104）1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院；2.北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院#第一作者、通訊作者丁偉，浙江大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科周立新，北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院病理科1.3辦法：1.3.1實驗一：取相似份量提煉的動物脂肪（豬油），分別加入95%乙醇、無水乙醇和二甲苯，觀察豬油不同時間段的變化狀況。1.3.2實驗二：將富含脂肪的人腸系膜及結(jié)腸組織經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定16小時后，直接放入75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、二甲苯、無水乙醇和二甲苯（1:1）混合液中，放置最長24小時，觀察組織以及試劑的變化。1.3.3實驗三：將286塊帶脂肪的人體胃腸組織、乳腺組織手術(shù)標(biāo)本一分為二，二分之一按照75%乙醇60分鐘、85%乙醇60分鐘、95%乙醇（I）120分鐘、95%乙醇（II）120分鐘、無水乙醇（I）60分鐘、無水乙醇（II）60分鐘、二甲苯（I）45分鐘、二甲苯（II）45分鐘傳統(tǒng)流程解決。另二分之一按照75%乙醇60分鐘、85%乙醇60分鐘、95%乙醇（I）120分鐘、95%乙醇（II）120分鐘、無水乙醇60分鐘、無水乙醇+二甲苯（1：1）60分鐘、無水乙醇+二甲苯（1：1）45分鐘、二甲苯45分鐘改良流程解決。對2種解決流程解決的組織進行石蠟包埋，常規(guī)切片，以脂肪組織切片的完整與破損作為評分原則，進行切片質(zhì)量比較。1.3.4對傳統(tǒng)及改良流程中95%乙醇、無水乙醇、無水乙醇+二甲苯（1：1）的沉淀物進行油紅O染色。1.3.5統(tǒng)計前一種月采用傳統(tǒng)辦法解決的日常工作切片質(zhì)量與采用改良辦法后一種月日常工作的切片質(zhì)量，評分原則采用用等級醫(yī)院檢查原則。1.3.6對改良流程中95%乙醇、無水乙醇、無水乙醇+二甲苯（1:1）試劑內(nèi)的沉淀物進行微譜分析。2.成果2.1實驗一：豬油倒入二甲苯10秒內(nèi)就被徹底溶解；倒入95%乙醇的豬油，浸泡48小時后，無明顯變化；倒入無水乙醇的豬油，浸泡48小時后，外表略干燥，并出現(xiàn)少量細小的顆粒懸浮在試劑里（見圖1）。2.2實驗二：固定充足的富含脂肪人腸及系膜組織分別放入75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、二甲苯、無水乙醇+二甲苯（1:1）混合液24小時后，肉眼可見組織在75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇無明顯變化；倒入二甲苯的組織，組織里的水將二甲苯隔離開來，產(chǎn)生乳白色的油水隔離膜；而放入無水乙醇+二甲苯（1:1）混合液的組織開始出現(xiàn)透明狀（見圖2）。2.3286塊帶脂肪的人體胃腸組織、乳腺組織采用傳統(tǒng)與改良流程的切片質(zhì)量，見附表1：附表1：286塊帶脂肪的人體胃腸組織、乳腺組織采用傳統(tǒng)與改良流程的切片質(zhì)量比較質(zhì)量辦法胃（72塊）腸（134塊）乳腺（80塊）總計完整破損完整破損完整破損完整破損傳統(tǒng)辦法264653613941118（41.26%）168（58.74%）改良辦法6571268737264（92.31%）22（7.69%）2.4統(tǒng)計采用傳統(tǒng)及改良二種辦法在日常工作中一種月的切片質(zhì)量，見附表2。附表2：二種不同辦法在日常工作中的切片質(zhì)量辦法成績傳統(tǒng)辦法（16549塊）改良辦法（15465）優(yōu)秀16232（98.08%）15376（99.42%）良好317（1.92%）89（0.58%）合格00不合格002.5改良流程解決的組織蠟塊在日常切片時，比傳統(tǒng)流程處的組織蠟塊明顯好切，且切片平整，容易連片，蠟塊不內(nèi)陷。2.6沉淀物的油紅O染色：傳統(tǒng)流程85%乙醇、95%乙醇第I道表面有油滴浮在上面，而沉淀為少量的白色顆粒（油紅O不著色）、95%乙醇第II道白色粗顆粒沉淀（油紅O著色）、無水乙醇第I道白色細顆粒（油紅O著色）、無水乙醇第II道白色細顆粒沉淀（油紅O著色）。改良流程無水乙醇以前（包含無水乙醇）的成果和傳統(tǒng)流程相似，但無水乙醇+二甲苯第I道和第II道剛開始使用時，肉眼無沉淀物產(chǎn)生（離心后液體有少量油紅O著色），解決到1800塊左右組織后，黃色細顆粒狀沉淀開始出現(xiàn)（油紅O著色），并且增加速度明顯，其量明顯多于無水乙醇產(chǎn)生的沉淀；到3000塊左右組織時，無水乙醇+二甲苯第II道也開始出現(xiàn)大量沉淀（油紅O著色）（見圖3）。2.6微譜檢測成果：沉淀物均為飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，詳見附表3組分名稱作用95%乙醇質(zhì)量含量/%無水乙醇質(zhì)量含量/%無水乙醇+二甲苯質(zhì)量含量/%十四酸/C14:0飽和脂肪酸0.9280.8860.911棕櫚酸/C16:0飽和脂肪酸17.31313.17417.502硬脂酸/C18:0飽和脂肪酸3.413.2023.835油酸/C18:1n9c不飽和脂肪酸43.8536.41943.075亞油酸/C18:2n6c不飽和脂肪酸18.35314.19919.917亞麻酸/C18:3n3不飽和脂肪酸0.6850.6940.906二十酸/C20:0飽和脂肪酸0.4550.3024.607二十烯酸/C20:1不飽和脂肪酸4.70310.1535.224二十烯/C20:2不飽和脂肪酸0.4290.710.68二十二烯酸/C22:1n9不飽和脂肪酸3.49212.2944.023附表3：95%乙醇、無水乙醇、無水乙醇+二甲苯沉淀物內(nèi)成分檢測3.討論組織前解決中固定、脫水、脫脂都是比較重要的環(huán)節(jié)，脫水過程中組織樣本應(yīng)充足的脫水和脫脂，否則石蠟不能滲入組織從而起到較好的支撐作用，技術(shù)人員無法切出完整的切片。切片后的蠟塊與空氣接觸，組織內(nèi)的水份揮發(fā)而產(chǎn)生凹陷、干涸，不利于患者后繼檢測以及蠟塊的長久保存。乙醇是一種較好的固定劑和脫水劑，運用“相似相溶原理”將組織內(nèi)的水分置換出來。組織經(jīng)充足固定后，乙醇在組織解決環(huán)節(jié)重要起到的是脫水作用，而二甲苯起到透明作用[1]，我們始終認為乙醇在組織解決過程中起到脫脂的作用[2]，然而，我們通過對提煉動物脂肪（豬油）在乙醇和二甲苯內(nèi)的體現(xiàn)，證明真正起到溶解脂肪的試劑是二甲苯。二甲苯是由45%～70%的間二甲苯、15%～25%的對二甲苯和10%～15%鄰二甲苯三種異構(gòu)體所構(gòu)成的混合物。能與無水乙醇、乙醚和其它許多有機溶劑混溶是非極性溶劑，脂肪不溶于水易溶于乙醚、氯仿、苯等非極性溶劑中，因此，與我們的實驗成果相符。在組織解決過程中，乙醇通過滲入逐步脫去取材組織內(nèi)的水，當(dāng)乙醇濃度低時，液體含水量高，組織表面的脂肪被洗滌浮在液體的表面，當(dāng)組織進入高濃度乙醇（95%以上）后，通過乳化作用，將組織內(nèi)少量脂肪酸置換出組織，懸浮在脫水試劑里，這些顆粒靜止時就沉淀下來，隨著乙醇濃度增加和脫水時間的延長，顆粒干燥、脆裂變小，當(dāng)組織進入二甲苯后，脫水干凈的脂肪被溶解成肉眼看不見的細小顆粒彌散在二甲苯里。我們把95%乙醇I、95%乙醇II、無水乙醇、無水乙醇+二甲苯懸浮液進行離心，對離心后的沉淀物分別進行油紅O染色，其成果95%乙醇II、無水乙醇、無水乙醇+二甲苯沉淀物為陽性，證明均為脂肪，沉淀物的微譜檢測成果也證明了這一點。如果組織內(nèi)含有水，我們通過實驗二發(fā)現(xiàn)這類組織就是長時間浸在二甲苯里，二甲苯也不能滲入到組織里，更無法將脂肪溶解。這就解釋了在日常工作中，由于乙醇在油脂中滲入速度比其它組織的滲入速度要慢的多[3][4]，在有限的組織脫水時間里（需要在規(guī)定的時間內(nèi)完畢），往往會造成較厚的組織或含脂肪的組織脫水不徹底，組織內(nèi)殘留的水份，妨礙了二甲苯有效的滲入到組織內(nèi)溶脂或替代乙醇的作用，造成組織浸蠟不充足，難以切片。有作者提出在二甲苯透明前，使用乙醇與二甲苯液解決30分鐘能夠使脫水變的徹底[5]。當(dāng)使用了無水乙醇和二甲苯混合液后，二甲苯能夠?qū)⒚撍蓛舻耐獗碇究焖偃芙?，從而增進無水乙醇的滲入，無水乙醇與二甲苯協(xié)同交替作用，達成一邊脫水一邊溶脂的功效，使脂肪或有脂肪包裹的組織得到從分的脫水與透明，確保石蠟有效的浸透，切片的完整性明顯提高（見圖4、5、6）。在實驗組286塊脂肪組織切片中，完整性從41.26%提高到92.31%，固然，這也有一定的極限，過厚或固定不充足的脂肪組織也無法得到完美的解決,約占7.69%。另不含脂肪的取材組織，也由于這一改良流程脫水、透明充足，即使切片質(zhì)量在鏡下無明顯差別，但在切片過程中薄、平整、更容易切。在日常工作評分原則中，周邊脂肪的切片不全，對切片優(yōu)片率的評分影響不大，但總體切片的優(yōu)片率還是從98.08%上升到99.42%。由于組織脫水充足即使長時間浸泡在二甲苯中，并不會出現(xiàn)組織發(fā)硬、發(fā)脆的現(xiàn)象[6]，因此，我們認為將分別使用乙醇、二甲苯液傳統(tǒng)流程改為以等量混合使用乙醇-二甲苯液進行脫水流程更科學(xué)，合用于日常工作中組織樣本的常規(guī)解決。感謝北京安貞醫(yī)院病理科王偉老師予以本文指導(dǎo)。（本文為中國研究型醫(yī)院學(xué)會病理專委會技術(shù)學(xué)組共同研究的課題）。圖1相似份量的豬油分別加入95%乙醇、無水的乙醇、二甲苯5秒時的現(xiàn)象圖2相似份量的豬油分別加入95%乙醇、無水的乙醇、二甲苯48小時后的現(xiàn)象圖3人腸系膜脂肪組織及結(jié)腸組織通過充足固定后直接放入75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、二甲苯及無水乙醇和二甲苯混合液中，解決24小時后的狀況圖4解決了4200塊組織后，50ml液體內(nèi)的沉淀物量圖5油紅O染色的成果圖6人腸系膜脂肪組織及結(jié)腸組織通過充足固定后梯度脫水，傳統(tǒng)辦法解決后脂肪組織中間不透明圖7改良辦法解決后脂肪組織透明度好圖8傳統(tǒng)流程解決的脂肪組織HE染色，脂肪有破損圖9改良流程解決的脂肪組織HE染色，脂肪切片較為完整圖10用改良辦法解決后的淋巴結(jié)切片掃描全圖圖11用改良辦法解決后的胃組織切片掃描全圖參考文獻：1.王泊沄，李玉松，黃高升等.病理學(xué)技術(shù)[M].人民衛(wèi)生出版社，.2．