重組人干擾素1b對(duì)呼吸道合胞病毒感染小鼠淋巴細(xì)胞亞群的影響

重組人干擾素1b對(duì)呼吸道合胞病毒感染小鼠淋巴細(xì)胞亞群的影響

呼吸道感染（gsv）是世界上嬰兒和老年人最常見的呼吸道感染之一，也是氣管哮喘的重要原因。干擾素與炎琥寧、喜炎平雖已用于RSV感染的治療,包括霧化吸入及肌注給藥,但尚缺乏嚴(yán)格的對(duì)照研究的實(shí)驗(yàn)資料及依據(jù)。本研究比較重組人干擾素α1b與炎琥寧、喜炎平均有抗RSV及調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群作用,其中重組人干擾素α1b(25.0μg)霧化吸入組最為顯著,現(xiàn)報(bào)道如下。材料和方法一、gg研究動(dòng)物中心scxk和rsva亞型ne選取64只清潔級(jí)雌性BALB/c小鼠,體重18~22g,購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào)SCXK(軍)2007-007);RSVA亞型Long株由首都兒科研究所提供;Hep2細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。二、抗小鼠cd3、cd8單克隆抗體重組人干擾素α1b注射液(商品名:運(yùn)德素,北京三元基因工程有限公司產(chǎn)品,50μg:1ml/支,批號(hào):20120823);炎琥寧(哈藥集團(tuán)三精加濱藥業(yè)有限公司產(chǎn)品,批號(hào):201108132);喜炎平(江西青峰藥業(yè)有限公司產(chǎn)品,批號(hào):20120704);PerC-P/Cy5標(biāo)記抗小鼠CD3單克隆抗體、PE標(biāo)記抗小鼠CD4單克隆抗體、EITC標(biāo)記抗小鼠CD8單克隆抗體及同型對(duì)照、紅細(xì)胞裂解液均購自BD公司。霧化器為德國百瑞有限公司生產(chǎn)。三、重組人干擾輔助下的rsv感染小鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)檢測(cè)方法在各條件下的應(yīng)用1.細(xì)胞培養(yǎng)、RSV懸液制備及病毒滴度測(cè)定:按照本實(shí)驗(yàn)室已往報(bào)道的方法。2.RSV感染小鼠模型建立及分組:將64只BALB/c小鼠隨機(jī)分為8組,分別為陰性對(duì)照組、RSV感染陽性組、重組人干擾素α1b(12.5μg/kg)腹腔注射組、重組人干擾素α1b(12.5μg)霧化吸入組、重組人干擾素α1b(25.0μg)霧化吸入組、利巴韋林123.3mg/kg腹腔注射組、喜炎平61.65mg/kg腹腔注射組、炎琥寧61.65mg/kg腹腔注射組。除陰性對(duì)照組外,其余7組小鼠均給予1%戊巴比妥鈉腹腔注射(3ml/kg),待小鼠麻醉后經(jīng)小鼠鼻腔滴入,RSV懸液(病毒滴度TCID50=10-4.6)100μl,連續(xù)2d。第3天觀察小鼠情況顯示小鼠煩躁不安,呼吸急促,精神萎靡,類似咳嗽、打噴嚏癥狀,表明RSV感染小鼠模型建立成功。3.藥物干預(yù)措施:用0.9%氯化鈉稀釋1支50μg/ml的重組人干擾素α1b注射液至25μg/3ml與12.5μg/3ml,分別加入簡(jiǎn)易霧化器,將對(duì)應(yīng)組小鼠放入5L透明玻璃圓瓶中,保持空氣通暢,連接霧化器進(jìn)行霧化吸入,15min/次,2次/d,連續(xù)5d,其余腹腔注射組,按重組人干擾素α1b12.33μg/kg、利巴韋林123.3mg/kg、喜炎平61.65mg/kg、炎琥寧61.65mg/kg連續(xù)腹腔注射5d,各組藥物均按應(yīng)用劑量稀釋至0.2ml生理鹽水中。4.標(biāo)本采集和檢測(cè):在藥物干預(yù)的第6天對(duì)各組小鼠進(jìn)行摘眼球取血,抗凝處理后送至本校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)教研室,采用美國FACSCalibur流式胞儀檢測(cè)外周血的CD3+CD4+與CD3+CD8+水平,并計(jì)算CD3+CD4+/CD3+CD8+。摘眼球取血后,脫頸處死小鼠,無菌剖取小鼠左肺,切取支氣管周1mm3肺組織,分別進(jìn)行固定、脫水、浸透、包埋、定位、修塊、超薄切片和染色等步驟,透射電鏡觀察小鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)改變。余肺組織浸入10%福爾馬林溶液充分固定24h后,送至西京醫(yī)院病理科,制成HE染色切片后,光鏡下觀察小鼠肺組織病理學(xué)改變,無菌剖取小鼠右肺,熒光定量RT-PCR法檢測(cè)小鼠肺組織RSV載量。四、數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布應(yīng)用SPSS16.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊性者,多組間比較采用One-WayANOVA法,組間兩兩比較采用LSD法;數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布者,多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn),組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn);以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果一、不同途徑感染rsv的小鼠肺組織病理組織學(xué)檢測(cè)光鏡下(圖1)可見陰性對(duì)照組小鼠肺組織小支氣管、細(xì)支氣管腔內(nèi)無分泌物及炎性細(xì)胞滲出;肺泡壁薄,厚度均勻;未見毛細(xì)血管充盈擴(kuò)張,未見炎性細(xì)胞浸潤;肺泡腔內(nèi)干凈,無異常物質(zhì)。RSV感染陽性組小鼠肺組織小支氣管、細(xì)支氣管腔內(nèi)大量分泌物及炎性細(xì)胞滲出;肺泡壁明顯增厚,厚度不均,滿視野可見大量炎性細(xì)胞浸潤;肺泡毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張充血,肺泡腔內(nèi)可見粉紅色水腫液生成。其余各組小鼠肺組織相比于RSV感染陽性組小鼠肺組織病理學(xué)炎性損傷均有不同程度減輕,其中重組人干擾素α1b(25.0μg)霧化吸入組效果最為明顯,可見小支氣管、細(xì)支氣管腔內(nèi)分泌物及炎性細(xì)胞滲出較少,未見毛細(xì)血管充盈擴(kuò)張;利巴韋林腹腔注射組炎性損傷明顯,可見肺泡壁明顯增厚,厚度不均,可見大量炎性細(xì)胞浸潤;肺泡毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張充血,肺泡腔內(nèi)可見粉紅色水腫液生成。二、不同藥物干預(yù)組感染陽性小鼠肺組織病理變化及臨床病理反應(yīng)透射電鏡(圖2)下觀察陰性對(duì)照組小鼠肺組織可見,肺泡隔寬度適中,無充血、水腫,肺泡腔大小正常,腔內(nèi)無異物。RSV感染陽性組可見典型肺實(shí)變表現(xiàn),肺泡隔顯著增厚,充血表現(xiàn)明顯,肺泡腔顯著縮小,腔內(nèi)可見壞死、脫落的碎片,可見大量水腫液。其余各組小鼠肺組織均有不同程度的炎性改變,肺泡隔明顯增厚,肺組織充血,可見凋亡細(xì)胞及細(xì)胞碎片,其中重組人干擾素α1b(25.0μg)霧化吸入組較其他藥物干預(yù)組炎性損傷程度減輕,可見肺泡隔略增厚,肺泡腔大小基本正常;細(xì)胞凋亡現(xiàn)象不明顯。三、兩組小鼠肺組織rsv載量檢測(cè)結(jié)果比較如表1所示,RSV感染陽性組小鼠肺組織RSV載量檢測(cè)結(jié)果最高,與其他各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。按重組人干擾素α1b腹腔注射組、利巴韋林腹腔注射組、重組人干擾素α1b(12.5μg)霧化吸入組、炎琥寧腹腔注射組、喜炎平腹腔注射組、重組人干擾素α1b(25.0μg)霧化吸入順序比較,小鼠肺組織RSV載量檢測(cè)結(jié)果依次減低,除喜炎平、炎琥寧兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外,其他各藥物干預(yù)組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=62.8,P<0.05)。四、各組小鼠外周血cd3+cd3+cd8+水平比較本研究結(jié)果顯示(表2),與RSV感染陽性組比較,其余各組小鼠外周血CD3+CD8+水平均升高,CD3+CD4+與CD3+CD4/CD3+CD8+水平均降低,各藥物干預(yù)組與RSV感染陽性組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。重組人干擾素α1b(25.0μg)霧化吸入組與其余各組比較,小鼠外周血CD3+CD8+水平升高,CD3+CD4+與CD3+CD4/CD3+CD8+水平降低,其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。喜炎平腹腔注射組、炎琥寧腹腔注射組CD3+CD8+水平高于其他3組(P<0.05),但兩組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。重組人干擾素腹腔注射組、重組人干擾素α1b(12.5μg)霧化吸入組CD3+CD8+水平高于利巴韋林腹腔注射組(P<0.05),但兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。重組人干擾素α1b(12.5μg)霧化吸入組、喜炎平腹腔注射組、炎琥寧腹腔注射組CD3+CD4/CD3+CD8+水平低于重組人干擾素腹腔注射組及利巴韋林腹腔注射組(P<0.05),但3組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。重組人干擾b對(duì)rsv感染小鼠的規(guī)劃與檢測(cè)結(jié)果影響RSV是嬰幼兒下呼吸道感染的重要病原,其主要病變累及毛細(xì)支氣管,亦可累及支氣管和肺泡而致RSV肺炎。本研究采用小鼠經(jīng)鼻滴RSV法建立感染小鼠模型,這是本實(shí)驗(yàn)室已引用多年的技術(shù),經(jīng)過光鏡、透射電鏡下觀察小鼠肺組織病理學(xué)改變;熒光定量PCR法檢測(cè)小鼠肺組織RSV載量,證實(shí)給小鼠經(jīng)鼻內(nèi)滴入適當(dāng)負(fù)荷量RSV可以建立RSV下呼吸道感染模型,為研究抗RSV打下了基礎(chǔ)。各組藥物劑量均按臨床小兒RSV感染藥物治療標(biāo)準(zhǔn)劑量換算所得?？紤]人與小鼠的劑量換算系數(shù)為12.33,即用于人的藥物劑量分別為重組人干擾素α1b(1μg/kg)肌肉注射、喜炎平(5mg/kg)腹腔注射和炎琥寧(5mg/kg)腹腔注射。T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞,CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在抗病毒感染中分別是重要的殺傷效應(yīng)細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞:細(xì)胞毒性T細(xì)胞可通過排粒作用釋放穿孔素和顆粒酶等細(xì)胞毒性物質(zhì),溶解靶細(xì)胞,同時(shí)還可通過釋放細(xì)胞因子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;調(diào)節(jié)性T被認(rèn)為能抑制T細(xì)胞及B細(xì)胞功能,起到細(xì)胞免疫的負(fù)調(diào)節(jié)作用。RSV感染可導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞亞群異常,對(duì)支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展有重要影響,而目前尚無特效藥物。重組人干擾素α1b與炎琥寧、喜炎平已用于RSV感染治療,可促進(jìn)臨床癥狀和體征恢復(fù),縮短病程。但尚缺乏嚴(yán)格的對(duì)照研究的實(shí)驗(yàn)資料及依據(jù)。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,重組人干擾素α1b與炎琥寧、喜炎平干預(yù)治療后,小鼠肺組織炎性損傷有不同程度恢復(fù),RSV載量顯著下降;重組人干擾素α1b(25.0μg)霧化吸入對(duì)RSV感染小鼠在免疫調(diào)節(jié)、肺組織病理學(xué)改變、肺組織病毒載量測(cè)定均較其他藥物有明顯效果。重組人干擾素α1b(12.5μg)霧化吸入組與重組人干擾素α1b腹腔注射組在肺組織病理學(xué)改變上兩組差異并不明顯,但優(yōu)于喜炎平腹腔注射組、炎琥寧腹腔注射組;炎琥寧抗RSV感染作用優(yōu)于喜炎平,這可能與其中藥成分的濃度有關(guān)。與RSV感染陽性組比較,重組人干擾素α1b與炎琥寧、喜炎平干預(yù)各組小鼠外周血CD3+CD8+水平升高,CD3+CD4+與CD3+CD4+/CD3+CD8+水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其中重組人干擾素α1b25.0μg霧化吸入組,調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群作用顯著,喜炎平、炎琥寧腹腔注射組次之,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),喜炎平與炎琥寧兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究結(jié)果還顯示上述各組藥物的抗RSV及調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群作用均強(qiáng)于利巴韋林腹腔注射。另外,重組人干擾素α1b(25.0μg)霧化吸入及重組人干擾素α1b(12.5μg)霧化吸入干預(yù)采取給藥時(shí)間與方法均相同,但在干預(yù)RSV