外源no供體對花楸樹胚胎萌發(fā)和幼苗生長的影響

外源no供體對花楸樹胚胎萌發(fā)和幼苗生長的影響

又名花楸樹，又名花木、山槐、山槐、臭檀木和木蘭。這是薔薇科和蘋果科。（楊庭輝，2011；2012）?；ㄩ睒渚哂休^強的耐性,可在冷(云)杉林中弱光下的腐殖土中萌發(fā),同時它具有很高的觀賞價值和木材使用價值?；ㄩ睒浯杭緷M樹銀花,夏季羽葉秀麗,秋冬季紅果滿枝,冬季果實可宿存(Yangetal.,2011)。在一些含有長壽命樹種的稠密樹林中,花楸樹的遺傳多樣性可能受到威脅。花楸樹為生長在小分裂群體中的伴生樹種,對高強度的種間競爭比較敏感。該樹種的更新能力較弱,最終可能局部消失(鄭健等,2007;許建偉等,2010)。因此,需要采取有效措施以保存花楸樹的種質(zhì)資源。目前關(guān)于花楸樹繁殖研究的報道以有性繁殖為主,組織培養(yǎng)(楊玲等,2010;Yang等,2012)、扦插(蘇喜廷等,2005)、嫁接(劉瑋等,2006)方面的研究較少。生產(chǎn)實踐中多以播種育苗的方式繁殖花楸樹苗木。花楸樹種子的深休眠特性增加了其播種育苗的難度(沈海龍等,2006;楊玲等,2008a)?；ㄩ睒浞N子經(jīng)過2~5℃低溫層積105天(低溫密封貯藏的種子)至120天(新采收成熟種子)才能萌發(fā)(楊玲等,2008a)。在2~5℃低溫層積過程中,花楸樹種皮內(nèi)ABA含量顯著降低,種皮和胚胎內(nèi)各種生長促進物質(zhì)的相對含量顯著增加(楊玲等,2008b)。將花楸樹種子用200mg·L-16-BA溶液浸泡2天后在25℃和5℃變溫條件下萌發(fā),可縮短種子萌發(fā)起始時間,提高種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(楊玲等,2009)。關(guān)于NO調(diào)節(jié)種子休眠打破和萌發(fā)的研究已有報道(Bethkeetal.,2004;Gibaetal.,2007;Gniazdowskaetal.,2007)。人們認為NO可能是由亞硝酸鹽和硝酸鹽分解產(chǎn)生的(Renataetal.,2006)。已有報道證明外源含氮化合物處理可以代替植物生長調(diào)節(jié)劑促進種子萌發(fā)和幼苗生長。如大麥(Hordeumvulgare)谷粒、擬南芥(Arabidopsisthaliana)種子和一些樹木種子經(jīng)過外源含氮化合物處理后,種子生活力和萌發(fā)率均可得到提高(Belignietal.,2000;Bethkeetal.,2004;Gniazdowskaetal.,2010)。更多關(guān)于NO功能的研究來自NO供體、NO抑制劑和特殊的抑制物的藥理學研究。最常用到的NO供體是硝普鈉(SNP)。SNP可以促進許多植物種子萌發(fā)(Gniazdowskaetal.,2010)。SNP對光下吸脹的種子萌發(fā)的促進效應(yīng)可以被NO抑制劑(PTIO或cPTIO)解除(Bethkeetal.,2004)。Gniazdowska等(2007)認為NO打破休眠與乙烯合成的增強相關(guān),即NO作為一種調(diào)控因子通過調(diào)節(jié)乙烯生物合成解除蘋果(Malusdomestica)胚休眠。進一步的研究表明:NO和氫氰酸(HCN)對休眠的蘋果胚萌發(fā)的促進效應(yīng)與胚中和萌發(fā)各個階段中H2O2和超氧陰離子含量的增加相關(guān)(Gniazdowskaetal.,2010)。推測活性氧和NO在種子萌發(fā)中與傳統(tǒng)的植物激素一起作為第二信使起作用(Gniazdowskaetal.,2010)。本文以我國東北地區(qū)野生花楸樹成熟合子胚胎為材料,利用室內(nèi)培養(yǎng)皿發(fā)芽法研究外源NO供體(SNP)、NO合成抑制劑(PTIO)、脫落酸(ABA)以及乙烯受體抑制劑(NBD)對花楸樹胚胎萌發(fā)和幼苗發(fā)育初期活性氧(ROS)積累的影響。研究結(jié)果為了解NO在花楸樹種子休眠解除和幼苗初期發(fā)育過程中的調(diào)控作用及其與植物內(nèi)源激素的關(guān)系奠定基礎(chǔ),為生產(chǎn)中改進花楸樹播種育苗方法、提高苗木產(chǎn)量提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1調(diào)查鑒定植物試驗材料于2011年9月下旬采自黑龍江省山河屯林業(yè)局鳳凰山林場,選取1株生長良好的野生成年母樹采集成熟果實,采回后調(diào)制出種子。種子調(diào)制方法同沈海龍等(2006)。1.2方法1.2.1種子吸脹劑試驗前選取籽粒飽滿、質(zhì)地均勻的休眠種子(平均千粒質(zhì)量為1.95g,平均含水量為8.39%,平均生活力為99.0%),在20℃±5℃下的蒸餾水中吸脹48h。將吸脹后的種子用0.2%(V/V)NaClO溶液攪拌浸泡10~15min后用清水沖洗干凈。在冰上剝除種皮,用裸胚進行試驗。1.2.2no-胚胎發(fā)芽效果測試1體外工作過程,把snp預(yù)處理的罪犯納入實驗,把其萌發(fā)后的不同發(fā)育條件下,所有罪犯通過不同培養(yǎng)條件確定生存率的標準,按照保證參照Gniazdowska等(2010)的方法。在500mL燒杯中放置一張用5mL0.05mol·L-1Hepes-KOH(pH值7.0)充分浸濕的濾紙,上面放90個剝離的胚胎。然后在同一燒杯里面再放置一個內(nèi)含5mL5mmol·L-1SNP溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)的小燒杯,最后用保鮮膜將500mL燒杯的口封好。氣態(tài)NO可以直接從SNP溶液中釋放出來。胚胎暴露在25℃、光下(光照強度為60μmol·m-2s-1)SNP溶液的蒸汽中3h。處理后,用蒸餾水沖洗胚胎并放置在被蒸餾水浸濕的濾紙上。對照為不經(jīng)過SNP預(yù)處理的裸胚。對照和預(yù)處理的胚胎在直徑9cm的培養(yǎng)皿中(每皿30個胚)在培養(yǎng)室內(nèi)的光照條件下萌發(fā)。萌發(fā)培養(yǎng)條件同前述預(yù)處理過程。對照和處理均設(shè)置3個重復。2snp預(yù)處理胚胎在5mmol·L-1SNP溶液的蒸汽中處理(預(yù)處理過程同上)3h后,在被3mL300μmol·L-1PTIO溶液浸濕的濾紙上吸脹。對照胚胎為不經(jīng)過SNP預(yù)處理,直接在含有3mL300μmol·L-1PTIO溶液的濾紙上吸脹。萌發(fā)培養(yǎng)條件同上。對照和處理均設(shè)置3個重復。3aba濃度對催化酶活性的影響胚胎在5mmol·L-1SNP溶液的蒸汽中處理(預(yù)處理過程同上)3h后,在含有3mL不同濃度ABA(0.1,0.3,1.0,3.0μmol·L-1)溶液浸濕的濾紙上吸脹。對照胚胎為不經(jīng)過SNP預(yù)處理,直接在含有上述不同濃度ABA溶液的濾紙上吸脹。萌發(fā)培養(yǎng)條件同上。對照和處理均設(shè)置3個重復。4體外吸劑預(yù)處理胚胎在5mmol·L-1SNP溶液的蒸汽中處理(預(yù)處理過程同上)3h后,在含有3mL1mmol·L-1NBD溶液浸濕的濾紙上吸脹。對照胚胎為不經(jīng)過SNP預(yù)處理,直接在含有3mL1mmol·L-1NBD溶液的濾紙上吸脹。萌發(fā)培養(yǎng)條件同上。對照和處理均設(shè)置3個重復。5胚胎萌發(fā)起始時間每天觀察并記錄。以2片子葉均變綠、胚軸和胚根均伸長為種子正常萌發(fā)的標志。統(tǒng)計不同處理后的胚胎萌發(fā)起始時間;萌發(fā)試驗第1,2,3,4,5,6,7,8天…,直到萌發(fā)結(jié)束時的每天的發(fā)芽率和各處理的最終發(fā)芽率。1.2.3體外受精孵化培養(yǎng)試驗1:胚胎在5mmol·L-1SNP溶液的蒸汽中處理(預(yù)處理過程同上)3,27,51,75h后,在含有3mL蒸餾水的濾紙上吸脹。對照胚胎為不經(jīng)過SNP預(yù)處理,直接在含有3mL蒸餾水的濾紙上吸脹。萌發(fā)培養(yǎng)方法和條件同上。對照和處理均設(shè)置3個重復。試驗2:胚胎在5mmol·L-1SNP溶液的蒸汽中處理(預(yù)處理過程同上)3h后,在含有3mL300μmol·L-1PTIO溶液浸濕的濾紙上吸脹。對照胚胎為不經(jīng)過SNP預(yù)處理,直接在含有3mL300μmol·L-1PTIO溶液的濾紙上吸脹。萌發(fā)培養(yǎng)方法和條件同上。對照和處理均設(shè)置3個重復。分別在試驗1和試驗2的第8天時取萌發(fā)形成的幼苗進行生理分析。將發(fā)芽測定結(jié)束后各處理胚胎萌發(fā)形成的葉片與初生根分別剪開,分成上部葉片(不接觸發(fā)芽床的子葉萌發(fā)形成的葉片)、下部葉片(接觸發(fā)芽床的子葉萌發(fā)形成的葉片)和根(初生根)3部份。然后各部分等量分成3份并稱量,用于下列指標的測定。1鮮質(zhì)量材料總吸光度測定將約0.05g的葉片用2∶1體積比的丙酮乙醇混合液在25℃下暗中浸提8h,然后用3層濾紙過濾,測652nm下濾液的吸光值。結(jié)果用每g鮮質(zhì)量材料在652nm下的吸光度值表示。用U表示一個OD值,葉綠素含量以U·g-1mL-1作單位。2含量測定稱取約0.05g的葉片用2mL0.1%(W/V)冷TCA在冰上勻漿。浸提液在4℃下15000g離心15min。取上清液0.5mL,加入0.5mL10mmol·L-1磷酸鉀緩沖液(pH值7.0),在390nm下測定吸收值。H2O2含量用每g鮮質(zhì)量材料在390nm下的吸光度值表示。用U表示一個OD值,H2O2含量以U·g-1mL-1作單位。3標準曲線的制作提取材料分別為胚胎萌發(fā)后形成的上部葉片、下部葉片和初生根。提取方法同上。將1.5mL上清液在1mL1mmol·L-1鹽酸羥胺(配制在50mmol·L-1磷酸鉀緩沖液中,pH值7.8)溶液中、25℃暗中孵化30min。取混合液0.5mL,連同0.5mL17mmol·L-1磺胺,0.5mL7mmol·L-1甲萘胺溶液一起在25℃暗中孵化30min。將混合液在14000g離心10min后,在540nm下測定吸光值。用NaNO2溶液制作標準曲線。利用標準曲線方程,將OD值轉(zhuǎn)換成NO2-1濃度,用U表示一個NO2-1值,超氧陰離子含量以U·g-1mL-1為單位。1.2.4數(shù)據(jù)處理方法采用Excel2003軟件進行數(shù)據(jù)處理和繪圖,采用DPS(唐啟義等,2002)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行方差分析、Duncan多重比較和相關(guān)性分析。百分數(shù)在統(tǒng)計分析前進行反正弦轉(zhuǎn)換。圖表中數(shù)據(jù)均為3次重復平均值,“±”之后為標準差。2結(jié)果與分析2.1no限制胚胎發(fā)芽2.1.1no對花楸樹胚胎萌發(fā)的影響SNP預(yù)處理對花楸樹胚胎萌發(fā)的影響如圖1所示,各處理對胚胎萌發(fā)影響的差異達到顯著水平(P<0.05)。萌發(fā)培養(yǎng)的第1天和第2天為子葉張開、子葉擴展和子葉變綠的過程。從第3天開始,部分胚胎的胚軸開始伸長。隨著萌發(fā)培養(yǎng)時間延長,正常萌發(fā)的胚胎比例增加。培養(yǎng)第8天時,SNP+PTIO處理的胚胎萌發(fā)率最高為86.67%(與對照的萌發(fā)率70.09%差異不顯著),其次是PTIO處理(萌發(fā)率為75.17%,與對照差異不顯著)。而SNP+H2O處理的胚胎萌發(fā)率最低(為56.67%,與對照差異不顯著)。從圖1可知,SNP+PTIO組合處理的胚胎萌發(fā)速度較快,在培養(yǎng)的第3天胚胎萌發(fā)率即可達到51.11%(約達到最終萌發(fā)率的60%),而其他處理的胚胎萌發(fā)速度與對照基本一致。SNP+PTIO組合處理的胚胎最終萌發(fā)率分別高于SNP或PTIO單獨處理的萌發(fā)率。說明NO的短期預(yù)處理可以影響花楸樹的胚胎萌發(fā),過多的外源NO抑制了胚胎的萌發(fā)。SNP預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)NO清除劑PTIO對胚胎萌發(fā)的抑制作用。2.1.2aba對snp培訓后胚胎萌發(fā)的影響ABA處理對花楸樹胚胎萌發(fā)的影響見圖2。培養(yǎng)第8天時,不同濃度ABA處理對胚胎萌發(fā)的影響達到極顯著水平(P<0.01)。較高濃度的ABA處理抑制花楸樹的胚胎萌發(fā)。培養(yǎng)第8天時,3.0μmol·L-1ABA處理的胚胎萌發(fā)率最低(為4.00%,與對照差異極顯著,P<0.01),其次是1.0μmol·L-1ABA(為34.32%,與對照差異顯著,P<0.05)。0.1μmol·L-1ABA和0.3μmol·L-1ABA處理的胚胎萌發(fā)率分別為63.47%和86.96%(二者與對照差異不顯著,P>0.05)。SNP與不同濃度(0.1,0.3,1.0,3.0μmol·L-1)ABA組合處理對花楸樹胚胎萌發(fā)的影響見圖3。胚胎從第3天開始萌發(fā)。培養(yǎng)第8天時,與對照相比,各處理對胚胎萌發(fā)的影響差異不顯著(P>0.05)。SNP+0.1μmol·L-1ABA處理的胚胎萌發(fā)率略高于對照(70.47%),SNP+0.3μmol·L-1ABA,SNP+1.0μmol·L-1ABA,SNP+3.0μmol·L-1ABA處理的胚胎萌發(fā)率略低于對照(分別為58.38%,57.89%和46.66%)。比較圖2和圖3可知,SNP預(yù)處理削弱ABA對胚胎萌發(fā)的抑制作用。推測SNP預(yù)處理可能減小胚胎對ABA的敏感性,從而削弱ABA對胚胎萌發(fā)的抑制作用,并且SNP的作用位點可能在ABA作用位點的上游。2.1.3發(fā)影響的差異NBD,SNP與NBD組合處理對花楸樹胚胎萌發(fā)的影響見圖4。胚胎從第3天開始萌發(fā)。培養(yǎng)第8天時,與對照相比,各處理對胚胎萌發(fā)影響的差異不顯著(P>0.05)。NBD單獨處理、SNP+NBD處理的胚胎萌發(fā)率均低于對照(分別為45.46%和42.18%)。由圖4可知,NBD處理抑制花楸樹胚胎萌發(fā),SNP預(yù)處理不能削弱NBD對胚胎萌發(fā)的抑制作用。說明花楸樹胚胎休眠的解除與乙烯具有密切的相關(guān)性。SNP與NBD組合處理不能提高胚胎發(fā)芽率,推測是由于SNP的作用位點處于NBD作用位點下游的原因。2.2no對活性氧ros積累的影響2.2.1no限制睡眠時維生素含量1葉片葉綠素含量方差分析結(jié)果表明:SNP預(yù)處理對胚胎上下部葉片的葉綠素含量和總?cè)~綠素含量的影響均達到極顯著水平(P<0.01)。多重比較結(jié)果表明:不同SNP處理時間對上下部葉片中葉綠素含量和總?cè)~綠素含量的影響均達到極顯著水平(P<0.01)(表1)。相關(guān)分析結(jié)果表明:上下部葉片中的葉綠素含量呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系(r=0.99),但與SNP處理時間的負相關(guān)關(guān)系不顯著(r=-0.26)。各處理中,上下部葉片中葉綠素含量最多的均是SNP處理3h。與對照相比,SNP處理3h的上部葉片中葉綠素含量增加8.88%,下部葉片中的葉綠素含量增加24.51%。這些差異均達到極顯著水平(P<0.01)。說明SNP短時間(3h)預(yù)處理胚胎可以顯著增加幼苗葉片中葉綠素含量。2ptio組合處理前后幼苗葉片葉綠素含量的變化方差分析結(jié)果表明:SNP與PTIO組合處理對胚胎上、下部葉片的葉綠素含量和葉綠素總含量的影響均達到極顯著水平(P<0.01)。各種處理間的多重比較結(jié)果見表2。與SNP單獨處理相比,SNP與PTIO組合處理對上部葉片中葉綠素含量影響不顯著(P>0.05),但極顯著增加下部葉片中的葉綠素含量和總?cè)~綠素含量(與對照的差異也達到極顯著水平,P<0.01)。與SNP+PTIO組合處理相比,PTIO單獨處理的胚胎萌發(fā)后其上部葉片中的葉綠素含量顯著增加(21.14%)(P<0.01),但下部葉片中的葉綠素含量則顯著減小(約減小35.01%)(P<0.01),二者的總?cè)~綠素含量差異不顯著(P>0.05)。說明SNP預(yù)處理使幼苗葉片中總?cè)~綠素含量增加的效應(yīng)不能被NO清除劑PTIO所削弱。NO清除劑PTIO同樣可以增加幼苗葉片中總?cè)~綠素含量。推測胚胎萌發(fā)形成幼苗后,葉片中葉綠素含量與NO含量相關(guān)不密切。2.2.2no限制因素對p22含量的影響1snp處理前后上、下葉片h2含量的相關(guān)性方差分析結(jié)果表明:SNP預(yù)處理對胚胎上部葉片H2O2含量的影響不顯著(P>0.05),對下部葉片細胞中的H2O2含量和總H2O2含量的影響均極顯著(P<0.01)。多重比較結(jié)果見表3。相關(guān)分析結(jié)果表明:上、下部葉片中的H2O2含量不相關(guān),二者與SNP處理時間的正相關(guān)關(guān)系不顯著(r=0.48)。各處理中,SNP處理75h的上、下部葉片中H2O2含量均為最多。與對照相比,SNP處理75h的上部葉片中H2O2含量增加0.45%,下部葉片中的H2O2含量增加1260.75%。SNP處理75h的上下部葉片中差異達到極顯著水平(P<0.01)。說明SNP預(yù)處理可以顯著引起幼苗葉片中H2O2含量增加。2ptio對上、下葉片中h2含量的影響方差分析結(jié)果表明:SNP與PTIO組合處理對胚胎上下部葉片的H2O2含量和總H2O2含量的影響差異不顯著(P>0.05)(表4)。與SNP單獨處理相比,SNP預(yù)處理后的PTIO處理減少上、下部葉片中H2O2含量,總H2O2含量相應(yīng)減少。與SNP+PTIO組合處理相比,胚胎一直在PTIO中吸脹的處理,使上部葉片細胞中的H2O2含量增加34.04%,但顯著減小下部葉片中的H2O2含量(約51.94%),總H2O2含量也被減小。說明SNP預(yù)處理引起的幼苗葉片中H2O2含量增加可以被NO清除劑PTIO所減少。2.2.3no限制對超氧陰離子含量的影響1超氧陰離子含量與snp處理時間的關(guān)系方差分析結(jié)果表明:SNP預(yù)處理對胚胎上部葉片超氧陰離子含量的影響不顯著(P>0.05),下部葉片及根系中超氧陰離子含量的影響均極顯著(P<0.01),對總超氧陰離子含量的影響極顯著(P<0.01)。多重比較結(jié)果見表5。相關(guān)分析結(jié)果表明:上、下部葉片、上部葉片與根系中超氧陰離子含量的正相關(guān)關(guān)系顯著(P>0.05),下部葉片與根系中超氧陰離子含量的正相關(guān)關(guān)系極顯著(r=0.94),根系中超氧陰離子含量與SNP處理時間的負相關(guān)關(guān)系顯著(r=-0.84),但上、下部葉片中超氧陰離子含量與SNP處理時間不相關(guān)。各處理中,SNP處理3h的上、下部葉片及根系中超氧陰離子含量均為最多。與對照相比,SNP處理3h的上部葉片中超氧陰離子含量增加0.41%,下部葉片中的超氧陰離子含量增加19.57%,根系中超氧陰離子含量減少22.26%。說明SNP短時間預(yù)處理可以增加幼苗下部葉片中超氧陰離子含量,隨著處理時間延長,則使幼苗各部分構(gòu)件中的超氧陰離子含量以及總超氧陰離子含量減少。2．ptio對下片超氧陰離子含量的影響方差分析結(jié)果表明:SNP與PTIO組合處理對胚胎上、下部葉片及根系的超氧陰離子含量以及超氧陰離子總含量的影響均不顯著(P>0.05)(表6)。與SNP單獨處理相比,SNP預(yù)處理后的PTIO處理增加上部葉片及根系中超氧陰離子含量,但使下部葉片中的超氧陰離子含量減少。與SNP+PTIO組合處理相比,胚胎一直在PTIO中吸脹的處理,使上部葉片細胞中的超氧陰離子含量增加4.01%,下部葉片中的超氧陰離子含量增加21.86%,使根系中的超氧陰離子含量下降34.71%。說明PTIO處理可抑制SNP預(yù)處理引起的下部葉片中超氧陰離子含量增加。PTIO對根部超氧陰離子含量的抑制作用可以被SNP預(yù)處理削弱。3預(yù)處理對花楸樹幼苗發(fā)育的影響本研究結(jié)果表明,SNP短時間預(yù)處理可以影響花楸樹胚胎萌發(fā)。NO清除劑(PTIO)具有抑制胚胎的萌發(fā)作用,這種抑制效應(yīng)可以被SNP預(yù)處理逆轉(zhuǎn)。研究結(jié)果支持NO能夠影響種子休眠解除的結(jié)論。NO抑制劑的試驗說明NO是一種種子休眠的內(nèi)源性調(diào)節(jié)閥。NO能夠促進許多植物種子的萌發(fā),特別是光敏感種子的萌發(fā)(Gibaetal.,2007)。NO對植物種子萌發(fā)的作用具有濃度效應(yīng),低濃度的NO對種子萌發(fā)有促進作用,高濃度NO則抑制種子萌發(fā)(Gibaetal.,2007)。本研究中使用5mmol·L-1SNP預(yù)處理3h的試驗方法是參考Gniazdowska等(2007)報道的用于蘋果胚胎萌發(fā)研究所使用的濃度。在培養(yǎng)第8天時統(tǒng)計胚胎萌發(fā)率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNP+PTIO處理的花楸樹胚胎萌發(fā)率最高(86.67%,高于對照),而SNP+H2O處理的胚胎萌發(fā)率最低(56.67%,低于對照)。說明5mmol·L-1SNP預(yù)處理3h對于花楸樹裸胚來說處理濃度過高,因此當使用PTIO清除掉多余的NO后,胚胎萌發(fā)率得到提高。這提示在今后進一步的研究中應(yīng)該適當降低SNP處理濃度或是減少SNP處理時間。同時,本研究結(jié)果也間接證明了NO對植物種子萌發(fā)具有濃度效應(yīng)的結(jié)論。較高的ABA含量是維持花楸樹種子休眠的重要調(diào)控因子(楊玲等,2008b)?；ㄩ睒湫虏墒詹⒄{(diào)制干燥后的種子中含有較高的ABA含量,在2~5℃低溫層積過程中花楸樹種皮內(nèi)ABA含量顯著降低(楊玲等,2008b)。本