鼻咽癌血漿eb病毒dna定量檢測(cè)的研究進(jìn)展

鼻咽癌血漿eb病毒dna定量檢測(cè)的研究進(jìn)展

嬰兒病毒（abv）是1968年從北京大學(xué)和腫瘤細(xì)胞發(fā)現(xiàn)的嗜人類b細(xì)胞的皮疹病毒。它以線性雙鏈dna的形式存在，大約172kg。EBV感染與鼻咽癌、淋巴瘤等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān),在人體中主要以潛伏感染形式存在,因此血液中存在多種病毒基因產(chǎn)物如EBNAs、EBERs、各種潛伏膜蛋白及EBV相關(guān)的抗原、抗體。目前,在鼻咽癌中常用的篩查指標(biāo)EBV殼抗原IgA抗體(VCA-IgA)和早期抗原IgA抗體(EA-IgA),其變化水平落后于體內(nèi)EBV的變化,不能及時(shí)反映腫瘤消長和疾病進(jìn)展的關(guān)系。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者外周血中檢測(cè)到的EBVDNA可以隨腫瘤消長而變化,能有效監(jiān)測(cè)鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展情況,是一種優(yōu)于VCA-IgA、EA-IgA的腫瘤檢測(cè)指標(biāo)。1ebv細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)Chan等用DNA酶切和超高速離心后定量法證實(shí),血漿中EB病毒DNA(EBVDNA)以游離DNA片段而非完整病毒顆粒的形式存在于細(xì)胞外,絕大多數(shù)游離DNA片段大小在82~181kb之間。檢測(cè)血漿中EBV游離DNA片段的方法主要有常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、半定量巢式PCR和實(shí)時(shí)定量PCR(realtimeqPCR,RT-qPCR),后者在靈敏度、特異度和準(zhǔn)確定量等方面優(yōu)于前兩者,故為最常用的方法。各種PCR均是通過檢測(cè)特定的DNA片段來實(shí)現(xiàn)定性或定量的,EBV的常用目標(biāo)片段有EBNA-1、EBNA-2、BXLF-1基因及BamHI-w區(qū)域,均能夠得到相似的陽性結(jié)果。BamHI-w區(qū)域是EBV的高度保守和高度重復(fù)序列,因病毒株不同可重復(fù)10~12次,檢測(cè)該片段能夠提高臨床檢測(cè)的靈敏度及特異度,因此臨床實(shí)驗(yàn)中多用BamHI-W區(qū)域作為檢測(cè)的目標(biāo)片段。各項(xiàng)研究由于所采用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、PCR設(shè)備及方法上的差異,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間存在明顯差異性。影響因素主要有幾個(gè)方面:(1)游離EBVDNA的片段多在181bp以內(nèi),因此PCR所選擇的擴(kuò)增子應(yīng)盡可能在181bp以內(nèi),不同的擴(kuò)增子所得到的定量結(jié)果有差異;(2)PCR所使用的循環(huán)數(shù)、試劑、引物或探針不同,檢出率和定量結(jié)果也有差異。因此構(gòu)建EBVDNA的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品來統(tǒng)一實(shí)驗(yàn)條件,制定國際通用的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)能夠讓各實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果具有可比性,進(jìn)而使血漿EBVDNA能夠成為一個(gè)通用的血液學(xué)指標(biāo)。Mutirangura等運(yùn)用RT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn),31%的鼻咽癌患者血清EBVDNA為陽性,而曾感染過EBV的82名健康對(duì)照者血清中并未檢出,說明血清中的EBVDNA是腫瘤源性的,且統(tǒng)計(jì)分析指出腫瘤細(xì)胞凋亡與血漿EBVDNA獨(dú)立相關(guān)(P=0.046)。Lin等比較了99例鼻咽癌患者血漿和原發(fā)腫瘤的EBV基因型,并分別對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序,也證實(shí)了血漿EBVDNA來源于整合了EBV的鼻咽癌細(xì)胞,能很好地反映體內(nèi)腫瘤的負(fù)荷狀況。對(duì)于EBVDNA具體的入血機(jī)制尚未完全清楚,目前多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為,原發(fā)部位腫瘤細(xì)胞將EBVDNA直接釋放入血,并非病毒在外周血中復(fù)制的作用。血漿EBVDNA的含量與腫瘤細(xì)胞凋亡數(shù)成正相關(guān),且在細(xì)胞凋亡過程中,脫氧核苷酸酶切割通常使DNA裂解為181bp以內(nèi)的小片段,因此其入血機(jī)制很可能與細(xì)胞凋亡裂解相關(guān),而與宏觀的腫瘤入侵周圍血管床無明顯相關(guān)性。2血漿ebv-dna的相關(guān)性Hsiao等采用常規(guī)PCR技術(shù)檢測(cè)鼻咽癌患者血漿EBV-DNA陽性率為38.9%(14/36),健康對(duì)照組檢出率為3.6%(1/28)。當(dāng)PCR循環(huán)數(shù)由35增加到50時(shí),患者及對(duì)照組的檢出率分別為72.2%(26/36)和10.7%(3/28)。Tan等應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)游離EBVDNA片段,鼻咽癌患者的檢出陽性率明顯高于正常人群,鼻咽癌患者DNA定量(每毫升的中位拷貝數(shù)為2043mL)和正常人群(中位拷貝數(shù)為0)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0005)。這與其他相關(guān)研究的結(jié)果一致,說明了血漿EBVDNA在鼻咽癌診斷上的價(jià)值。Leung等對(duì)血漿EBVDNA游離片段在鼻咽癌診斷中的特異度和靈敏度分析得出其靈敏度為95%(95%CI:91%~98%),特異度為98%。其與VCA-IgA在假陰性結(jié)果上幾乎沒有重疊,但能夠糾正75%(27/36)的VCA/IgA假陽性的錯(cuò)誤,故用兩者結(jié)合診斷靈敏度可高達(dá)99%。2011年的一項(xiàng)Meta分析納入了15項(xiàng)關(guān)于血漿及血清EBV-DNA水平與鼻咽癌相關(guān)性的研究,同樣證實(shí)了EBVDNA在鼻咽癌診斷上良好的靈敏度(89.1%)和特異度(85%)。因此,血漿EBVDNA水平可以作為鼻咽癌診斷的一種新的特異度和靈敏度較好的血清學(xué)指標(biāo),其與血清VCA-IgA結(jié)合能進(jìn)一步提高診斷價(jià)值。在Lin等的研究中,Ⅲ、Ⅳ期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者治療前DNA的中位拷貝數(shù)分別為681、1703和291940/mL(P<0.001),提示血漿EBVDNA水平與腫瘤分期有明顯的相關(guān)性。臨床分期越晚,血漿中EBV-DNA濃度水平越高。2006年,Leung等針對(duì)血漿EBVDNA與分期作了更詳細(xì)的研究認(rèn)為,血漿EBVDNA水平是總生存(overallsurvival,OS)的獨(dú)立預(yù)后因素,僅次于UICC分期。對(duì)于Ⅰ、Ⅱ期患者來說,高的血漿EBVDNA水平提示預(yù)后不良(P=0.0003),高血漿EBVDNA水平組(包括6%的Ⅰ期患者和38%的Ⅱ期患者)與Ⅲ期患者的生存期望相同或者更差;反之,低血漿EBVDNA水平組(包括大部分Ⅱ期患者)的生存期望與Ⅰ期患者相同。此外,EBVDNA水平也被證實(shí)與中國2008TNM分期呈正相關(guān),能較好在國內(nèi)臨床中得到應(yīng)用。故認(rèn)為,血漿EBVDNA的水平與臨床分期密切相關(guān),可以用來補(bǔ)充TNM分期。但Leung等的分析中使用的分期標(biāo)準(zhǔn)為UICC1997版本,且剔除了所有M1和病理類型為Ⅰ型的患者,對(duì)于臨床的指導(dǎo)價(jià)值有所削弱,期待采用最新分期標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。3治療前后血漿乙醇鈉濃度對(duì)癌癥復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)作用3.1治療前血漿ebv-dna的濃度與疾病預(yù)后的關(guān)系Lo等的數(shù)據(jù)顯示治療后1年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者其治療前血漿EBVDNA中位拷貝數(shù)(41756/mL)遠(yuǎn)高于未出現(xiàn)臨床進(jìn)展的患者(5807/mL)。治療前血漿EBVDNA濃度是鼻咽癌的獨(dú)立預(yù)后因素,其濃度每增加10倍,局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的相對(duì)危險(xiǎn)度達(dá)4.5(95%CI:1.9~10.4)。Lin等發(fā)現(xiàn)治療前血漿EBV-DNA的基線濃度與腫瘤負(fù)荷呈正相關(guān),與疾病預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。鼻咽癌治療后復(fù)發(fā)的患者其治療前血漿中的EBV-DNA濃度明顯高于無復(fù)發(fā)者(中位拷貝數(shù)分別為:3035和1202/mL;P=0.02)。治療前血漿EBV-DNA濃度在1500/mL的界值以下的患者OS和無復(fù)發(fā)生存(recurrence-freesurvival,RFS)都長于治療前濃度超過界值者(P<0.05)。侯雪等也得出相似結(jié)論,治療前EBV-DNA濃度超過界值點(diǎn)(2000/mL)的患者,其2年OS(P=0.05)也低于EBV-DNA濃度在界值之下的患者。在各項(xiàng)研究中所選取的治療前、后血漿EBVDNA濃度的界值點(diǎn)各不相同,都是基于前人實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)和秩檢驗(yàn)對(duì)OS及PFS異質(zhì)性的估量所選擇的,Chan等的結(jié)果表明,界值點(diǎn)取在治療前4000/mL,治療后500/mL能夠很好地區(qū)分不同組別的預(yù)后,但對(duì)于血漿EBVDNA預(yù)后預(yù)測(cè)的總體效應(yīng)而言,界值點(diǎn)選取的不同并無差別。3.2血漿ebv-dna的表達(dá)情況受復(fù)制者非重復(fù)性治療的患者一般在其未轉(zhuǎn)移的初治鼻咽癌,治療后持續(xù)存在的血漿EBV-DNA是預(yù)后的不良因素。Wang等采用血漿EBVDNA檢測(cè)結(jié)合PET-CT的方法對(duì)治療后的NPC患者進(jìn)行60個(gè)月的隨訪發(fā)現(xiàn),治療后血漿中持續(xù)存在可檢測(cè)EBVDNA的患者幾乎都出現(xiàn)了復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,且預(yù)測(cè)的靈敏度優(yōu)于PET-CT,能夠篩選出需要用PET-CT尋找確切轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)灶的部分患者,提高了準(zhǔn)確性。Lin等對(duì)152例接受標(biāo)準(zhǔn)同期放化療的患者進(jìn)行了78個(gè)月的隨訪,同樣發(fā)現(xiàn)治療后持續(xù)存在EBVDNA的患者5年OS和RFS顯著低于治療后血漿DNA陰性者(P<0.0001),且COX分析指出,血漿EBVDNA濃度水平對(duì)于預(yù)后的預(yù)測(cè)效力要優(yōu)于包括病理類型、T分期、N分期及總分期在內(nèi)的其他臨床參數(shù)。初治后出現(xiàn)復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移或治療前已有轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者中,血漿EBVDNA仍有重要預(yù)測(cè)價(jià)值。Xin等對(duì)127例接受姑息化療的鼻咽癌患者的血漿EBV-DNA進(jìn)行定量分析,治療前血漿EBVDNA濃度低于中位基線濃度(2.33×105/mL)與EBVDNA濃度等于或高于中位值者相比,中位OS和PFS明顯延長(P<0.001)。姑息化療后血漿EBV-DNA降至不可檢測(cè)水平的患者,不僅緩解率(CR+PR)明顯高于血漿EBVDNA持續(xù)存在者,生存期也明顯延長。與初治無轉(zhuǎn)移鼻咽癌中的研究結(jié)果一致,Xin等指出治療前血漿EBVDNA低且治療后降至不可檢測(cè)水平的一組患者,5年的OS和PFS均明顯優(yōu)于其他各組患者?？梢哉J(rèn)為,治療后血漿EBVDNA持續(xù)存在者出現(xiàn)臨床疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)更高,預(yù)后更差,可以考慮采取縮短隨訪間隔、增加隨訪項(xiàng)目等手段。與治療前血漿EBVDNA相比,治療后EBVDNA濃度對(duì)于鼻咽癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)意義更大,尤其是治療后血漿EBVDNA水平能否及時(shí)降到0。因?yàn)橹委熀笸庵苎腥源嬖诘腅BV-DNA可能是由治療前或者治療時(shí)游離于循環(huán)中的潛在微轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞所釋放,這些未完全清除的腫瘤細(xì)胞通過其他臨床檢查較難發(fā)現(xiàn)。但是僅靠EBVDNA濃度并不能進(jìn)一步將可能發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部或區(qū)域復(fù)發(fā)的患者區(qū)分開。Leung等發(fā)現(xiàn)血漿EBVDNA在局部復(fù)發(fā)患者中檢出率明顯低于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和治療前鼻咽癌患者。龔曉昌等也發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者血漿EBV-DNA陽性率和拷貝數(shù)與前述報(bào)道相似,而局部復(fù)發(fā)患者血漿EBV-DNA的陽性率遠(yuǎn)低于前者。這可能是因?yàn)榉暖煼磻?yīng)引起了局部嚴(yán)重纖維化和血管狹窄閉塞導(dǎo)致局部復(fù)發(fā)的腫瘤細(xì)胞無法將EBVDNA釋放入血。鼻咽癌雖對(duì)放療敏感,但根治性放療后的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或局部復(fù)發(fā)仍是治療失敗的原因。評(píng)價(jià)鼻咽癌療效的影像學(xué)手段如鼻咽MRI、CT等檢查多在放化療后立即進(jìn)行,此時(shí)鼻咽部及其周圍組織由于放療反應(yīng)產(chǎn)生的腫脹等因素,易影響解剖觀察,單純依靠影像學(xué)不能早期反映療效,預(yù)測(cè)預(yù)后。而血漿EBV-DNA濃度能很好地輔助影像學(xué)手段,預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)及生存狀況,是一項(xiàng)非侵入性的分子生物學(xué)檢查指標(biāo),更有望成為篩選鼻咽癌高?；颊?指導(dǎo)放化療綜合治療的標(biāo)準(zhǔn)之一。3.3血漿ebv-dna的早期消失和預(yù)后放療中血漿EBVDNA的中位半衰期為3.8d(四分位間距:2.4~4.4d),治療后血漿EBVDNA在幾乎所有患者中都能觀察到下降,僅下降的速率和程度不一致。Xin等發(fā)現(xiàn)姑息化療后血漿EBVDNA早期下降的患者中位PFS、OS明顯延長,血漿EBVDNA的早期消失可以作為一項(xiàng)療效反應(yīng)的早期指標(biāo)。Wang等研究34例轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的晚期鼻咽癌患者化療后第1個(gè)月的血漿EBV-DNA清除率(t1/2)也認(rèn)為清除率較血漿EBVDNA含量對(duì)療效的預(yù)測(cè)效果更好。由于該研究樣本量小,CR、PR率高于普遍報(bào)道,提示可能存在患者選擇的偏移。Hsu等將研究的樣本量增至73例,發(fā)現(xiàn)治療前的血漿EBVDNA清除率與DNA定量同樣能有效預(yù)測(cè)預(yù)后。但既往研究對(duì)血漿EBVDNA的清除率及其定量結(jié)果在整個(gè)治療過程中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律、是否對(duì)療效、分期等有預(yù)測(cè)價(jià)值的相關(guān)研究較少,可以作為一個(gè)新的突破點(diǎn)繼續(xù)研究。4血漿ebvna釋放入血的機(jī)制綜上所述,監(jiān)測(cè)不同時(shí)期的血漿EBVDNA在鼻咽癌早期診斷、臨床分期、療效監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷等方面有重要的臨床意義,優(yōu)于傳統(tǒng)檢測(cè)抗體的方法。在未來的研究中,仍有一些問題需要解決:(1)腫瘤細(xì)胞中的EBVDNA釋放入血的具體機(jī)制;(2)規(guī)范化血漿EBVDNA的定量檢測(cè)流程