水稻減數(shù)分裂粗線期染色體的原位雜交分析

水稻減數(shù)分裂粗線期染色體的原位雜交分析

fluentiflimate的sitima轉(zhuǎn)換技術(shù)是一個(gè)重要的分子遺傳技術(shù)，可以確定dna序列的位置和序列。該技術(shù)在人類(lèi)和動(dòng)物育種研究中得到了廣泛應(yīng)用，如重組結(jié)構(gòu)的分子成像、染色結(jié)構(gòu)的分析、物種之間的比較、序列結(jié)構(gòu)的分析等。在植物研究中，特定的dna序列在ct上的定位、遺傳因素的研究、多倍體的起源、矩陣間的關(guān)系、混合和染色輸出段的鑒定等。在過(guò)去的十年里，fish技術(shù)取得了很大的發(fā)展。換句話說(shuō)，可以通過(guò)兩個(gè)不同的dna檢測(cè)獲得的最小距離有所增加。從1.3mm/s的中期染色體中，fish發(fā)展為分辨率為100kg/s的減少氏族數(shù)據(jù)的分解，在50kb的中間層中建立了fish，在2kb的中間層中建立了原始軌跡。fish作為確定染色體中軌道位置和序列的最有效、最精確的工具。近年來(lái)，fish技術(shù)可以建立成像物理譜（遺傳cytogenetic軌跡），探討物理譜與遺傳譜的關(guān)系，分析遺傳譜的變化值與物理譜之間的關(guān)系?，F(xiàn)在，植物中使用減數(shù)、分裂粗線和中間那一級(jí)別的dna纖維作為原始線，可以獲得高分辨率的物理譜。近年來(lái)，該技術(shù)已在許多植物中應(yīng)用[10、11、12、13、14、15、16、17、18]。水稻(Oryza.sativaL.)是世界三大糧食作物之一,其基因組(420～460Mb)是所有禾本科植物中最小的,僅是模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)的4倍,并且具有重復(fù)序列少(30%～50%),基因密度大,與其它單子葉植物具有高度共線性(collinearity)和同線性(synteny)等特點(diǎn),因此,水稻已被選為除擬南芥之外的模式植物.國(guó)際水稻全基因組序列測(cè)定(RGP)計(jì)劃正在進(jìn)行中,粳稻和秈稻基因組的草圖序列已經(jīng)完成.但是,與蓬勃的水稻分子生物學(xué)研究相比,由于水稻(OryzasativaL.)的中期染色體很小,染色體的辨認(rèn)非常困難,水稻分子細(xì)胞遺傳學(xué)方面的研究進(jìn)展相對(duì)滯后.利用FISH技術(shù)在水稻染色體上對(duì)DNA序列定位的報(bào)道不多[16,24,25,26,27,28].對(duì)于水稻間期和粗線期染色體的FISH,也僅有Jiang等和Cheng等的報(bào)道,國(guó)內(nèi)目前尚未見(jiàn)報(bào)道.本文采用BAC(bacterialartificialchromosome)克隆作為探針,對(duì)水稻間期核、減數(shù)分裂染色體、有絲分裂中期染色體進(jìn)行了熒光原位雜交,在此基礎(chǔ)上對(duì)水稻不同層次上FISH的分辨率進(jìn)行了比較.1材料和方法1.1ymasap.indica-gurga基因,u3000e供試水稻為秈稻“廣陸矮4號(hào)”(Oryzasativassp.indicacv.GuangluaiNo.4)由中國(guó)科學(xué)院國(guó)家基因研究中心提供.1.2探針標(biāo)記的制備供試探針為水稻BAC克隆H0102C09、H0201G08,由中國(guó)科學(xué)院國(guó)家基因研究中心提供.利用標(biāo)準(zhǔn)的堿裂解法提取BACDNA.所有探針均用切刻平移法標(biāo)記,H0102C09用生物素-11-dUTP(Sigma)標(biāo)記,H0201G08用地高辛-11-dUTP(BoehringerMannheimBiochemica)標(biāo)記,0.5mol/LNa2EDTA終止液終止.SepharoseCL-6B(Sigma)凝膠柱離心純化,點(diǎn)印漬檢測(cè)標(biāo)記效果.1.3花粉囊的制備水稻減數(shù)分裂染色體制片參照Kurataetal.(1981)程序稍加修改,在花粉母細(xì)胞處于減數(shù)分裂時(shí)期,以卡諾氏固定液固定幼穗后,從小穗中剝?nèi)』ǚ勰?用2%果膠酶(Serva)和2%纖維素酶(Serva)1∶1(V/V)混合,在28℃下酶解1.5h左右,吸去酶液,水洗3次,火焰干燥法制片,-20℃保存?zhèn)溆?1.4ss-4-4-瓊脂糖-1,3,4-四甲基-5,5,5,5,5,5,5,5-四甲基-5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,7,7.依照Z(yǔ)wick的方法稍加改動(dòng).5mol/LNaCl和雙蒸水稀釋總DNA至0.5g～1000g/L,NaCl終濃度為0.3mol/L.稀釋后的總DNA裝于5mL離心管中,高壓滅菌鍋中滅菌5～9次,每次5min,取1μL在1%瓊脂糖中電泳,直至DNA片段在100～1000bp之間.取出5mL離心管,置于冰上.根據(jù)Cot-1DNA動(dòng)力公式Cot=1=c(mol/L)×t(s)計(jì)算打斷DNA完全復(fù)性所需的時(shí)間.取出打斷后的DNA置于沸水中處理10min,冰上放置1min,65℃水浴復(fù)性,復(fù)性時(shí)間為所計(jì)算的Cot-1時(shí)間.加入S1核酸酶(1U/μgDNA)輕輕混勻,37℃下10～30min,S1核酸酶能特異性降解線形DNA中的單鏈.加入等體積平衡酚抽提1～2次,以終止S1酶的作用.氯仿/異戊醇抽提2次,再用氯仿抽提1次.1/3體積的3mol/L醋酸鈉(pH7.0)和1/3體積異丙醇沉淀DNA,適量TE(pH7.0)溶解沉淀,紫外分光光度計(jì)或溴化乙錠法測(cè)其濃度,-20℃保存?zhèn)溆?1.5抗生物素-短板片sc原位雜交及信號(hào)檢出參照前人的方法,并加以適當(dāng)修改.每張染色體制片所用的雜交混合液(50μL)含約60～100ng標(biāo)記的探針DNA片斷,50%去離子甲酰胺(Sigma),10%硫酸葡聚糖(Sigma),0.5μLssDNA,2×SSC,0.5～2μgCot-1DNA.雜交混合液在沸水中煮10min后,迅速置于冰上放置10min以上.雜交在37℃下進(jìn)行,約16～24h.熒光檢出程序包括以下步驟:①雜交后的片子依次在42℃下于20%的甲酰胺、2×SSC溶液、0.1×SSC溶液中各漂洗15min;0.1%TritonX-100室溫下處理5min;PBS室溫下處理2×5min.之后每張加50μL(10mg/L)羊抗生物素-FITC偶聯(lián)物(goatanti-BiotinFITCconjugate)(Sigma)和鼠抗地高辛(mouseanti-digoxigenin)(BoehringerMannheimBiochemica),37℃于保濕皿中溫育30min后,室溫下PBS溶液洗3×5min;②每張制片加50μL(11mg/L)兔抗羊-生物素偶聯(lián)物(rabbitanti-goatbiotinconjugate)(Sigma)和羊抗鼠-地高辛偶聯(lián)物(sheepanti-mouseIg-digoxigenin)(BoehringerMannheimBiochemica),37℃于保濕皿中溫育30min后,室溫下PBS溶液洗3×5min;③每張制片加50μL(11mg/L)羊抗生物素-FITC偶聯(lián)物和羊抗地高辛-羅丹明偶聯(lián)物(sheepanti-digoxigenin-rhodamine)(BoehringerMannheimBiochemica),37℃于保濕皿中溫育30min;④PBS洗3×5min后,每張制片加40μL(10mg/L)PI(propidiumiodide)或DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)復(fù)染.制片在OlympusBX60熒光顯微鏡下觀察.利用SensysCCD1401E系統(tǒng)和V++軟件合成照片.Photoshop軟件進(jìn)行測(cè)量和圖片處理.2雙色熒光原位雜交BAC克隆H0102C09,H0201G08,是分別用水稻第4染色體上的RFLP標(biāo)記R2502,R1854篩選出的,位于水稻第4染色體3.1和5.1cM處.用生物素和地高辛標(biāo)記的BACH0102C09和H0201G08對(duì)水稻染色體制片進(jìn)行雙色熒光原位雜交,分別表現(xiàn)為綠色和紅色信號(hào).從圖版中可以看出,紅色和綠色信號(hào)均位于染色體的短臂末端.在早粗線期,紅色和綠色信號(hào)彼此鄰近,并未重疊(圖1-1),在粗線期,兩信號(hào)點(diǎn)緊緊靠在一起,并有很小部分的重疊,兩信號(hào)點(diǎn)中心的物理距離為0.36μm,綠色信號(hào)點(diǎn)距染色體最末端有一定的距離(圖1-2),在終變期,可以看到二價(jià)體上的3～4個(gè)紅綠重疊信號(hào)(圖1-3),有絲分裂中期染色體上紅色和綠色信號(hào)相互重疊成為黃色,位于第4染色體的短臂最末端(圖1-4),有絲分裂間期上紅色和綠色信號(hào)分開(kāi)(圖1-5),兩者間的物理距離為(2.06±1.15)μm.圖1-6為放大的粗線期(A)和中期(B)染色體,可明顯看出,紅色和綠色信號(hào)在粗線期染色體上的分開(kāi)和在有絲分裂中期染色體上的重疊.3討論3.1粗線期染色體fps分析從結(jié)果可以看出,水稻不同時(shí)期FISH的分辨率具有較大的差異,中期染色體的染色質(zhì)濃縮程度最高,染色體小,第4染色體短臂上相距2cM的探針的雜交信號(hào)相互重疊,不能分開(kāi).減數(shù)分裂粗線期染色體已完成了同源染色體配對(duì),與有絲分裂中期染色體相比,染色質(zhì)更為疏松,其長(zhǎng)度通常比相應(yīng)的中期染色體大10～20倍.不同植物中粗線期染色體比中期染色體大的倍數(shù)有所不同,如黑麥中為7倍,玉米中是10倍,番茄15倍,擬南芥20倍,水稻為40倍.因此,粗線期染色體FISH的分辨率大大提高.Cheng等(2001)發(fā)現(xiàn),水稻第10染色體短臂末端rDNA和BAC46C02間距為84kb,兩個(gè)信號(hào)點(diǎn)部分重疊,不能完全分開(kāi).長(zhǎng)臂末端BAC82M15和E14I11間距為134kb,從細(xì)線期到早粗線期,兩個(gè)信號(hào)點(diǎn)互不重疊,處于彼此接觸的狀態(tài),而在晚粗線期又有了部分重疊.短臂末端的BAC45D16和15O22間距為137kb,其信號(hào)點(diǎn)在細(xì)線期是分開(kāi)的,而到了偶線期就有了部分重疊.本結(jié)果也表明,水稻第4染色體短臂末端相距2cM的BACH0102C09,H0201G08的信號(hào)點(diǎn)在粗線前期,粗線期,終變期染色體上逐漸從彼此接觸,部分重疊狀態(tài)發(fā)展到完全重疊狀態(tài)(圖1-3),說(shuō)明粗線期染色體FISH在水稻第4染色體短臂上可以分辨2cM的探針.與中期和粗線期染色體相比,間期細(xì)胞核中的染色質(zhì)處于高度解旋狀態(tài),染色質(zhì)更為疏松,濃縮程度較低.Jiang等(1996)首次將間期FISH技術(shù)應(yīng)用在玉米研究中,發(fā)現(xiàn)相距140kb的pAI-Lc和pSh2.5.SstISaⅡ在間期核中間距為0.5μm,結(jié)果表明,第4染色體短臂上相距2cM的探針的紅色和綠色雜交信號(hào)可以完全分開(kāi)(圖1-5),相距(2.06±1.15)μm,但尚不能由此推出兩克隆片段間的實(shí)際距離,因?yàn)椴煌魑锛安煌旧w區(qū)域濃縮程度各不相同.另外,探針在染色體上的位置,是位于常染色質(zhì)區(qū)還是異染色質(zhì)區(qū),也是影響分辨率的一個(gè)因素.如DeJong等在番茄粗線期染色體FISH中發(fā)現(xiàn),常染色質(zhì)區(qū)域的分辨率為120kb,而異染色質(zhì)區(qū)域則為1.2Mb.因而,水稻不同染色體上及染色體的不同區(qū)域FISH的分辨率也會(huì)有一定的差異.根據(jù)分辨率的不同,可以分析染色體上常染色質(zhì)和異染色質(zhì)成分,對(duì)染色體結(jié)構(gòu)和功能分析具有十分重要的作用.3.2稻減數(shù)分裂染色體的制備水稻減數(shù)分裂染色體的制片方法主要有兩種,一種為壓片法,一種為酶解法.作者對(duì)這兩種方法都進(jìn)行了嘗試,結(jié)果都能得到較好的分裂相.但是,由于壓片法制片需要揭掉蓋片后才能用于原位雜交,比較麻煩,而且,在揭蓋片的時(shí)候,材料容易丟失,因此,我們認(rèn)為酶解法制片更易于原位雜交.為此,嘗試了酶解滴片法制備水稻減數(shù)分裂染色體.制片的關(guān)鍵是酶解要適度,實(shí)驗(yàn)表明,用2%的果膠酶和纖維素酶1∶1(V/V)混合,在28℃下酶解1.5h即可,在酶解的過(guò)程中,應(yīng)隨時(shí)制片觀察,以掌握酶解程度.當(dāng)酶解適度時(shí),小心將酶解液吸出,用雙蒸水輕輕洗2～3次,然后加入雙蒸水,用吸管輕輕吹打,低滲1～2h后,3600r/min離心5min,加固定液再固定10min,然后距離載玻片一定高度懸浮滴片,火焰干燥即可.利用這一方法,可以制備出水稻不同分裂時(shí)期的染色體制片.這一方法的優(yōu)點(diǎn)是載玻片背景比較干凈,染色體分散較好,且由于花粉囊壁細(xì)胞和花粉母細(xì)胞同時(shí)存在,因此在一張載玻片上可以同時(shí)觀察到體細(xì)胞中期染色體和減數(shù)分裂各時(shí)期的染色體,對(duì)于原位雜交非常有利.對(duì)于水稻花粉母細(xì)胞粗線期染色體的制片,另一個(gè)關(guān)鍵的步驟是一定要選擇好時(shí)期,因?yàn)橐粋€(gè)花藥內(nèi)的花粉母細(xì)胞的發(fā)育時(shí)期是同步的,對(duì)于廣陸矮4號(hào),旗葉和下一葉的葉耳間距大約為-3～-1cm時(shí)處于減數(shù)第一次分裂的前期到中期,可以得到較多的分裂相.3.3粗線期染色體的結(jié)構(gòu)和功能粗線期染色體熒光原位雜交與體細(xì)胞中期染色體熒光原位雜交相比具有如下優(yōu)點(diǎn).1)與有絲分裂中期染色體相比,染色質(zhì)更為疏松,Fransz等(2000)首次用高分辨的粗線期FISH作出了擬南芥第4染色體短臂的整合細(xì)胞遺傳學(xué)圖(integratedcytogeneticmap),定量分析了第四染色體短臂異染色質(zhì)鈕(heterochromaticknob)和著絲粒區(qū)域的染色質(zhì)的濃縮程度和結(jié)構(gòu)組成情況.之后,Kulikova等(2001)用這一技術(shù)將苜蓿(Medicagotruncatula)的粗線期FISH和遺傳圖進(jìn)行了整合.Haupt等(2001)將遺傳圖,序列分析及熒光原位雜交數(shù)據(jù)進(jìn)行整合,對(duì)擬南芥著絲粒1(CEN1)區(qū)域進(jìn)行了分析.Cheng等(2001)利用這一技術(shù)作出了水稻第10染色體的物理圖譜.高分