cck-8對嗎啡依賴sh-sy5y細胞內(nèi)源性阿片系統(tǒng)的影響

cck-8對嗎啡依賴sh-sy5y細胞內(nèi)源性阿片系統(tǒng)的影響

阿片中毒后，在復雜的神經(jīng)和內(nèi)政部網(wǎng)絡變化過程中，各種生物活性物質的分泌和變化。鈣膽收縮素（cck-8）是迄今為止體內(nèi)最高的抗膽紅素藥物，參與調整疼痛、焦慮、儲存和藥物中毒的過程。內(nèi)源性苦參堿活性物質包括三種主要的苦參堿活性物質，這些物質通過不同類型的苦參堿受體發(fā)揮復雜多樣的生理作用。長期應用阿片類藥物可以引起整個內(nèi)源性阿片系統(tǒng)的功能紊亂,以適應進入體內(nèi)的大量阿片類物質。有研究證明,CCK受體與阿片受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多個部位重疊分布,CCK與內(nèi)源性阿片系統(tǒng)的相互作用與阿片成癮過程密切相關。本實驗觀察了CCK-8對μ阿片受體(MOR)結合力及前腦啡肽原(proenkephalin,PENK)、前阿黑皮質素原(proopiomelanocortin,POMC)基因表達的影響,以明確CCK與內(nèi)源性阿片系統(tǒng)的相互關系,探討CCK-8在嗎啡成癮中的相關作用機制,為CCK-8在戒毒方面的應用提供相關實驗依據(jù)。1材料和方法1.1檢測試劑和試劑盒SH-SY5Y細胞(上海拜力生物科技有限公司),DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司),胎牛血清(美國PA公司),青/鏈霉素(美國PA公司),EDTA-胰酶(美國PA公司);鹽酸嗎啡(沈陽第一制藥廠);CCK-8、納洛酮、DAMGO([D-Ala2,N-Me-Phe4,Gly5-ol]-enkephalin)、全反式維甲酸(美國Sigma公司),[3H]-DAMGO(放射比活度2.1×1015Bq·mol-1,濃度3.7×1010Bq·L-1,美國PerkinElmer公司);TRIzol(美國Invitrogen公司),DEPC(美國Invitrogen公司),PrimeScriptTMRTregentKit(日本Takara公司),SYBRPremixExTaqTMPCR試劑盒(日本Takara公司);LanceTM384cAMP檢測試劑盒(美國PerkinElmer公司),PCR儀(美國AB公司),7500型Real-TimePCR儀(美國AB公司),NanoDrop1000微量核酸蛋白檢測儀(美國基因公司),多功能酶標儀(瑞士Tecan公司),LS-6500型液體閃爍計數(shù)儀(美國Beckman公司)。1.2細胞培養(yǎng)和活性SH-SY5Y細胞接種于含有10%胎牛血清、100U·ml-1青霉素、100U·ml-1鏈霉素的D-MEM/F-12培養(yǎng)基中,在37℃下持續(xù)通入5%CO2和95%空氣培養(yǎng)。將細胞按1×109cells·L-1的密度接種在25ml培養(yǎng)瓶中,置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后更換培養(yǎng)液并加入終濃度為10μmol·L-1全反式維甲酸(retinoicacid,RA)分化6d,每兩天更換1次培養(yǎng)液。分化6d后,更換為不含RA的無血清培養(yǎng)基,加入不同處理因素開始實驗。參照文獻建立細胞嗎啡依賴模型,加入10μmol·L-1嗎啡作用48h,用10μmol·L-1納洛酮進行催促戒斷,以cAMP超射檢驗模型是否成功。1.3重組細胞的制備10μmol·L-1嗎啡作用48h后,棄去培養(yǎng)液,用PBS沖洗細胞2次,加入Versene′s液(EDTA0.372g·L-1,NaCl8.0g·L-1,KCl0.20g·L-1,KH2PO40.20g·L-1,Na2HPO41.15g·L-1,葡萄糖0.2g·L-1,pH7.4)室溫孵育3～5min后收集細胞,4℃、300×g離心5min,棄上清液。用HBSS液(CaCl20.14g·L-1、KCl0.4g·L-1、KH2PO40.06g·L-1、MgCl2·6H2O0.10g·L-1、MgSO4·7H2O0.10g·L-1、NaCl8.0g·L-1,NaHCO30.35g·L-1、葡萄糖1.0g·L-1、Na2HPO4·7H2O0.09g·L-1,pH7.4)沖洗一次后,重懸細胞并計數(shù),調整細胞濃度至1×109cells·L-1。LanceTM384cAMP檢測試劑盒測定納洛酮催促戒斷15min后細胞內(nèi)cAMP含量。1.4tis-cl緩沖液及膜蛋白制備液中3.參照文獻提取細胞膜蛋白,調整蛋白濃度至0.3g·L-1。放射配基結合反應測定MOR結合力的體系為:總結合管中依次加入100μlTris-Cl緩沖液、100μl膜蛋白制備液、100μl[3H]-DAMGO(0.5～8nmol·L-1);非特異結合管中依次加入50μlTris-Cl緩沖液、100μl膜蛋白制備液、50μlDAMGO(5μmol·L-1)、100μl[3H]-DAMGO;并選取2nmol·L-1[3H]-DAMGO濃度點,加入10-12～10-6mol·L-1CCK-8進行抑制實驗。將反應體系充分混勻后4℃孵育過夜,次日抽濾、洗膜?？靖珊笾糜陂W爍液中靜置過夜,BeckmanLS-6500型液體閃爍計數(shù)儀測量放射性活度(Countper-minute,CPM),特異結合為總結合與非特異結合之差。1.5cck1r、cck2r、cck2r-35-acagctctgrt-355555555555555555555555555555.5.4.7.4.7.4.7.4.7.4.7.7.7.7.7.4.7.4.7.7.7.7.7.7.7.4.35.35.35.35.35.35.35.35.35.4.4.4.4.4.4.4.4.35.35.35.35.4.4.4.35.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.5.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35.35各組取500ng總RNA經(jīng)PrimeScriptTM反轉錄試劑盒合成cDNA。PremixExTaqTMPCR試劑盒擴增目的基因,所用引物由上海生物技術工程公司合成,序列如下:PENK(上游5′-ACCACTCTGGGCGACCTAC-3′,下游5′-GGATGGCAGTGATAATGAGG-3′),POMC(上游5′-ACAGGCACTTGCTGGATTCTC-3′,下游5′-GCAGGTTGCTTTCCGTGGT-3′),MOR(上游5′-GTCAACTTGTCCCACTTAG-3′,下游5′-GCATAATGAAGGCGAAG-3′),CCK1R(上游5′-CCCACTCCCTCCATTGCT-3′,下游5′-CTGCTCCATTCTTATTCCTCTT-3′),CCK2R(上游5′-GACGCTTCGGTCATTAGA-3′,下游5′-AGGGAGGAGTGATGTTGC-3′),β-actin(上游5′-GGGACCTGACTGACTACCTC-3′,下游5′-ACTCGTCATACTCCTGCTTG-3′)。反應條件:95℃10min;95℃15s,60℃15s,40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳驗證。以β-actin作為內(nèi)參基因,△△Ct法分析基因的相對表達。1.6單因素方差分析所得數(shù)據(jù)用SPSS11.0進行統(tǒng)計學分析,以xˉ±sxˉ±s表示,各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(one-wayANOVA),用最小顯著差法(LSD)作兩兩比較。2結果2.1sh-sy5y細胞在細胞中的表達未分化的SH-SY5Y細胞呈類纖維細胞樣,用10μmol·L-1RA處理細胞6d后,細胞形態(tài)發(fā)生變化,胞體變小、變圓、伸出長而細的軸突,許多細胞胞體融合在一起形成類似神經(jīng)節(jié)樣結構,與文獻報道一致。SH-SY5Y細胞表達μ-阿片受體、CCK1及CCK2受體,并且用RA處理細胞6d后,μ-阿片受體、CCK1及CCK2受體的表達均增加(P<0.01,Fig1),分別為未分化細胞的(1.47±0.18)、(1.94±0.29)、(2.88±0.36)倍,說明SH-SY5Y細胞可用于本實驗細胞模型的建立。用10μmol·L-1嗎啡作用于RA分化6d的SH-SY5Y細胞48h后,給予10μmol·L-1納洛酮催促戒斷15min,使SH-SY5Y細胞內(nèi)cAMP含量增加(2.11±0.50)倍(Fig2),形成明顯的cAMP超射狀態(tài),說明慢性嗎啡依賴細胞模型建立成功。2.2cck-8抑制劑的致突變性選取蛋白濃度30μg、[3H]-DAMGO0.5～8nmol·L-15個濃度點、非標記配基DAMGO濃度10nmol·L-1、4℃孵育過夜作為放射配基結合分析的條件,測定了SH-SY5Y細胞μ阿片受體的結合活性,結果顯示:RA分化6d后的SH-SY5Y細胞μ阿片受體的Bmax值為(378.3±48.9)nmol·g-1Pro,Kd值為(0.79±0.09)(Fig3)。加入不同濃度(10-12～10-6mol·L-1)的CCK-8進行抑制實驗發(fā)現(xiàn),10-10～10-6mol·L-1CCK-8可以劑量依賴性地抑制阿片受體的結合活性(P<0.01,Fig4),并且此抑制作用可被CCK1及CCK2受體拮抗劑翻轉(P<0.01,Fig5)。因此,CCK-8可通過激活CCK受體抑制μ阿片受體的結合,發(fā)揮其抗阿片作用。2.3cck-8對pank、pomc表達的影響由Fig6可見,10-10～10-6mol·L-1CCK-8孵育RA分化6d后的SH-SY5Y細胞48h后,發(fā)現(xiàn)10-10～10-8mol·L-1的CCK-8對PENK、POMC的表達無影響(P>0.05,Fig6),隨著CCK-8的濃度增加,10-7、10-6mol·L-1CCK-8使PENK的表達較正常組增加(5.81±0.84)、(7.26±1.55)倍(P<0.01)、POMC表達較正常組增加(4.55±0.73)、(5.16±0.82)倍(P<0.01,Fig6)。因此,高劑量的CCK-8可促進內(nèi)源性阿片肽的釋放。2.4cck-8對pek、pomc表達的影響10μmol·L-1嗎啡作用于RA分化6d后的SH-SY5Y細胞48h后,PENK、POMC表達較正常組下降(0.43±0.10)和(0.37±0.07)倍(P<0.01,Fig7),給予10-10～10-6mol·L-1CCK-8與嗎啡共同孵育細胞后,10-8、10-7、10-6mol·L-1CCK-8使PENK、POMC表達增加(P<0.01,Fig7),PENK與正常組的相對表達值為(0.63±0.10)、(0.86±0.21)、(1.17±0.19),POMC與正常組的相對表達值為(0.46±0.10)、(0.60±0.11)、(0.96±0.11),10-10、10-9mol·L-1CCK-8對PENK、POMC表達無影響(P>0.05,Fig7)。因此,低劑量CCK-8對PENK、POMC的表達無明顯影響,但隨著其劑量不斷增加,CCK-8可上調嗎啡依賴后下降的內(nèi)源性阿片肽,調節(jié)嗎啡依賴后內(nèi)源性阿片肽系統(tǒng)的失衡。3cck-8對內(nèi)源性阿片系統(tǒng)的激活和調節(jié)CCK-8是目前已知作用最強的內(nèi)源性“抗阿片肽”,有學者認為內(nèi)源性CCK對抗阿片物質的作用可能是導致阿片成癮的機制之一,應用CCK受體拮抗劑能逆轉嗎啡耐受、減輕嗎啡戒斷癥狀。我們前期研究發(fā)現(xiàn)CCK受體拮抗劑可減輕嗎啡成癮大鼠的戒斷癥狀,證實了CCK-8的抗阿片作用;但是外源性給予CCK受體激動劑CCK-8慢性干預同樣可減輕戒斷癥狀,與CCK受體拮抗劑的作用一致;楊春曉等也發(fā)現(xiàn)CCK-8可降低嗎啡戒斷大鼠的戒斷癥狀?；仡櫼酝谔弁搭I域的系列研究發(fā)現(xiàn),Doi等曾報道CCK-8本身有鎮(zhèn)痛作用。比較發(fā)現(xiàn)外源性給予CCK-8的劑量要比內(nèi)源性CCK-8的含量高1000倍以上,因此CCK-8的效應可能與其濃度存在密切關系。內(nèi)源性阿片肽主要包括腦啡肽、內(nèi)啡肽、強啡肽三個家族,其前體物質分別為前腦啡肽原(PENK)、阿片-促黑素細胞皮質素原(POMC)和前強啡肽原(PYDN)。正常狀態(tài)下,內(nèi)源性阿片系統(tǒng)處于平衡狀態(tài),長期使用外源性阿片類物質一方面激活內(nèi)源性阿片系統(tǒng)引起獎賞效應,另一方面又打破內(nèi)源性阿片系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài),改變其表達與功能。例如,位于中腦腹側被蓋區(qū)中含PENK和POMC的神經(jīng)元可以加強多巴胺能神經(jīng)元的活動。長期使用阿片類物質則可抑制內(nèi)源性阿片肽的合成,減弱其對多巴胺能神經(jīng)元的正性強化作用。因此,CCK-8作為體內(nèi)最強的內(nèi)源性“抗阿片肽”,其與內(nèi)源性阿片系統(tǒng)的關系是機制探討的關鍵環(huán)節(jié)。我們以往研究發(fā)現(xiàn)海馬神經(jīng)元同時分布有阿片受體和CCK受體,且慢性嗎啡作用后μ阿片受體表達降低,CCK受體表達增加,且CCK-8可通過調節(jié)μ-阿片受體結合活性發(fā)揮作用。Wang等發(fā)現(xiàn)CCK-8能抑制阿片受體的結合力,使μ受體總數(shù)減少(Bmax降低),使κ受體親和力降低(Kd值上升),但不影響δ阿片受體的結合