-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

-乳蛋白（ii-l）是由乳腺癌上皮細胞合成的獨特乳液。它是反芻動物和豬以及其他乳液中的主要蛋白質(zhì)組成的。近年來研究證明：在人乳中也含有β-Lg，，但是含量極少。β-Lg在牛乳乳清中占蛋白質(zhì)總量的43.6%～50.0%，在脫脂牛乳中的含量約為2.0～4.0gL。。牛乳中的β-Lg分子量在18400左右，等電點為5.1～5.3，一共由162個氨基酸殘基組成，有2個遺傳變異體。β-Lg在牛乳中主要以二聚體形式存在，，由非共價鍵連接的2個單位亞基組成。在pH<3.55或pH>8.0時，β-Lg二聚體解離成單體。每個單體含有2個二硫鍵Cys66-Cys160和Cys106-Cys199，，還有1個Cys121自由硫氫基。β-Lg的三維結(jié)構(gòu)在中性pH值時是由8條反平行鏈組成的β桶狀結(jié)構(gòu)，，有1個α+1拓撲，桶外存在著一個具有3個轉(zhuǎn)角的α螺旋和第9條β鏈。在生理狀態(tài)下，β-Lg的二聚體像一個拉長的橢圓體，長約6.95nm，寬約3.6nm。。通過旋光色散和圓二色性技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，β-Lg的二級結(jié)構(gòu)包括10%～15%的α-螺旋、43%的β-折疊和47%的無序結(jié)構(gòu)。1乳清蛋白的提取世界上的乳清產(chǎn)量很大，乳清的開發(fā)和利用一直很受人們關(guān)注。乳清中蛋白質(zhì)含量較高，如何有效利用乳清蛋白成為乳品工業(yè)中急需解決的問題。β-Lg作為乳清蛋白的主要成分，對它的利用研究已成為熱點。綜合現(xiàn)有資料文獻，β-Lg利用研究主要有以下幾個方面。1.1-lg在食品工業(yè)上的應(yīng)用蛋白質(zhì)的功能特性與其理化性質(zhì)密切相關(guān)，如分子量、氨基酸組成及序列、結(jié)構(gòu)、表面靜電荷與有效疏水性等。由于β-Lg在分子水平上所具有的一些物理組成及結(jié)構(gòu)造成了其獨特的空間分子構(gòu)象和理化性質(zhì)，使得天然的β-Lg在食品工業(yè)中有著特殊的應(yīng)用。β-Lg直接應(yīng)用主要基于以下固有特性：對脂溶性維生素及脂肪酸的結(jié)合能力、對風(fēng)味物質(zhì)的保持力及較好的凝膠性能、特有的生物活性功能等。1.1.1-lg分子內(nèi)疏水孔穴與表面疏水裂縫的關(guān)系β-Lg具有很強的結(jié)合脂溶性維生素及脂肪酸的能力，可以作為像VA、VE等脂溶性營養(yǎng)物質(zhì)的添加載體，這可用于生產(chǎn)無脂或低脂且富含脂溶性維生素的營養(yǎng)食品。β-Lg對脂溶性維生素及脂肪酸起結(jié)合功能的區(qū)域位置曾經(jīng)存在爭議：根據(jù)X射線對β-Lg晶體的衍射結(jié)果，可對此功能區(qū)域的位置作出2種推斷：一種認為此區(qū)域位于β-Lg的內(nèi)部疏水孔穴，它是通過β-Lg分子內(nèi)的β桶狀疏水孔穴的開口處實現(xiàn)這一結(jié)合的；另一種認為此區(qū)域是β-Lg分子表面由疏水基團所形成的裂縫（該區(qū)域位于一個α螺旋與β桶結(jié)構(gòu)之間）。ZsilaF等（2002）通過圓二色性、原子吸收光譜、分子模型預(yù)測等技術(shù)明確了脂溶性維生素及脂肪酸的結(jié)合區(qū)域：即2種分子的結(jié)合部位不在同一位置，脂溶性維生素及脂肪酸的結(jié)合區(qū)域分別位于β-Lg分子內(nèi)部的疏水孔穴和表面的疏水裂縫。由于結(jié)合區(qū)域的特殊結(jié)構(gòu)，使得β-Lg對脂溶性維生素及脂肪酸有很大的結(jié)合強度，尤其對VD2與VE等脂溶性維生素。β-Lg不僅可以結(jié)合脂溶性小分子，而且能夠提高其在機體內(nèi)的轉(zhuǎn)運效率，促進這些物質(zhì)的吸收。KushibikiS等（2001）通過研究證明：當(dāng)在β-Lg存在的條件下，飼料中的幾種成分含量相等的情況下，動物肌肉中的VA、甘油三酸酯、長鏈脂肪酸的含量顯著提高(P<0.05）。1.1.2ph對-lg風(fēng)味物質(zhì)的保持力JouenneE等（2000）在研究一些風(fēng)味物質(zhì)（甲基酮、乙酸乙酯、檸檬油精等）與β-Lg相互作用時發(fā)現(xiàn)：在pH為3～9的范圍內(nèi)，β-Lg對于這些風(fēng)味物質(zhì)有著較強的保持力，并且這種保持力會隨著pH變化而改變。在pH=7.5時，由于靜電作用使得其對風(fēng)味物質(zhì)的保持力最強。此外，β-Lg的凝膠性質(zhì)優(yōu)于雞蛋蛋白，它優(yōu)越的膠體性質(zhì)和包水性質(zhì)可作為高效添加劑用于許多食品體系。如使用β-Lg膠體性質(zhì)來模擬和代替無脂食品中的動物油，開發(fā)低脂肉制品等產(chǎn)品。1.1.3抗氧化能力的研究NakajimaM等（1997）研究發(fā)現(xiàn)：β-Lg能在1mgmL的水平下使黑色素褪色，且進一步發(fā)現(xiàn)β-Lg在機體內(nèi)具有抑制酪氨酸酶活性的能力（酪氨酸酶可催化酪氨酸產(chǎn)生黑色素或其它色素）。他們還進一步證明，β-Lg能夠完全清除VA代謝物所形成的色素沉淀。此外，β-Lg還有提高機體抗氧化能力的功能。ZommaraM等（1998）研究證明，在體內(nèi)VE缺乏的情況下，β-Lg能夠顯著增加肝臟中的還原型谷胱甘肽，并有效提高細胞膜的抗氧化能力。這對β-Lg在化妝業(yè)上的應(yīng)用提供了可能。1.2-lg添加對乳清蛋白凝膠特性的影響乳清蛋白是一種敏感性蛋白質(zhì)，在一些理化條件下其性質(zhì)易發(fā)生不利于加工應(yīng)用的變化，這使得其應(yīng)用范圍受到很大限制。β-乳球蛋白作為乳清蛋白主要成分，它的性質(zhì)對乳清蛋白的性質(zhì)有重要影響。天然的β-Lg理化特性大都不利于在食品工業(yè)中進一步加工利用，如β-Lg的Cys121上游離的—SH在牛奶加工過程中會產(chǎn)生異味。β-Lg的主要改性基礎(chǔ)是β-Lg分子所具有的15個Lys、11個Asp以及Cys121等。Lys上的ε—NH2、Asp上的ω—COOH、Cys121上的游離—SH都有很強的反應(yīng)活性。當(dāng)β-Lg的這些具有較強活性的基團在理化的條件下發(fā)生改性后，它的性質(zhì)（溶解度、表面性質(zhì)、凝膠性和熱穩(wěn)定性等）會發(fā)生很多改變。1.2.1酯化衍生物及其應(yīng)用β-Lg分子上較多的活性基團給化學(xué)試劑對β-Lg的改性處理提供了反應(yīng)基礎(chǔ)。由于Lys上的ε—NH2以及His的咪唑基的反應(yīng)活性，使其可以與磷酸化試劑反應(yīng)。Woo等人（1983）發(fā)現(xiàn)6%（可被磷酸化基團）磷酸化的β-Lg在pH=5.0、Ca+2濃度為0.1molL時不經(jīng)加熱便可成凝膠。利用磷酸化的β-Lg的凝膠形成特性和高乳化力，可用來制造乳化食品和凝膠食品。Asp上的ω—COOH容易通過酰胺化和酯化反應(yīng)得以封閉，從而改變β-Lg的等電點。Mattarella等（1981,1982）研究表明：β-Lg經(jīng)過78%酰胺化后，其等電點從5.2附近上升至9.8和10.0。83%甲酯化和55%的乙酯化的β-Lg的等電點分別上升到9.8和9.7，而且經(jīng)乙酯化的β-Lg的乳化穩(wěn)定性非常強。這是由于酯化減少了β-Lg表面的自由-COOH所致。經(jīng)過酰胺化和酯化的β-Lg可分別用作干酪加工中的靜電凝乳劑和乳化食品的穩(wěn)定劑。此外，β-Lg與一些糖類物質(zhì)作用后也能改變β-Lg部分性質(zhì)。糖基能與β-Lg形成大量的鉸鏈，使得β-Lg分子內(nèi)部大量的芳香基團暴露，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子極性的變化，從而可以改變β-Lg的黏度。羧甲基環(huán)式糊精與β-Lg作用能顯著增強β-Lg的乳化性能。多聚糖對β-Lg性質(zhì)也有較大影響。MouecoucouJ等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，多聚糖能與β-Lg形成靜電復(fù)合體，降低β-Lg的聚集性，有效增大它的可溶性，并引起β-Lg可消化性的改變。1.2.2-lg作酰氯化劑在高壓處理下，β-Lg被蛋白酶水解的能力提高。BonomiF等（2003）研究了胰凝乳蛋白酶和胰酶對常壓及高壓（600MPa）處理后的β-Lg的水解效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在常壓狀態(tài)下，胰凝乳蛋白酶或胰酶根本不能接近并水解β-Lg的內(nèi)部疏水區(qū)域；在高壓狀態(tài)下，這一區(qū)域能得到有效水解。蛋白酶對其降解處理可以使其溶液黏度降低，溶解度、熱穩(wěn)定性、乳化、發(fā)泡力提高，尤其是乳化性及發(fā)泡能力提高最為顯著。谷氨酸轉(zhuǎn)移酶也被用于改善β-Lg的性質(zhì)。但一般條件下谷氨酸轉(zhuǎn)移酶對β-Lg的改性效果并不理想，因為β-Lg的改性位點僅有159、155位的Gln，所以對其性質(zhì)影響不大。NieuwenhuizenWF等（2004）對谷氨酸轉(zhuǎn)移酶對β-Lg的改性技術(shù)進行了改進，結(jié)果不僅使β-Lg第35、59、68、155位的Gln都能被有效修飾，而且使位于8、77、141位的Lys也被修飾。經(jīng)過多個活性基團修飾后的β-Lg的乳化及表面性質(zhì)得到極大的改善。1.3牛乳過敏癥的發(fā)病率天然的β-Lg是嬰兒牛乳過敏癥的主要致敏原。由于新生嬰兒消化道腸道上皮細胞可以吸收一些完整的蛋白質(zhì)進入體內(nèi)，因而易引發(fā)過敏反應(yīng)（人乳中幾乎不含β-Lg，而牛乳中β-Lg占總蛋白質(zhì)含量的8%～10%）。牛乳過敏癥在嬰兒期的發(fā)病率達到1.9%～5.2%,3月內(nèi)的發(fā)病率為2.3%～2.8%。如何減少β-Lg所致嬰兒牛乳過敏癥是嬰兒配方奶粉生產(chǎn)中急待解決的問題，消除牛奶中主要致敏原β-Lg的致敏性已成為國際乳制品加工技術(shù)研究的熱點之一。2.3.1單一依靠熱處理消除-lg的致敏性對β-Lg致敏部位的確定及其消除方法不太一致。一種認為β-Lg分子構(gòu)象對其致敏性有重要影響。為破壞β-Lg分子構(gòu)象，人們對熱處理的加工方法進行了研究。理論上熱處理能夠有效地使β-Lg的三級結(jié)構(gòu)解體并破壞它原有的空間構(gòu)象，從而消除β-Lg的致敏性。但是，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，β-Lg在熱處理后空間構(gòu)象遭到有效破壞，但熱處理變性后的β-Lg至少又產(chǎn)生一個原β-Lg所沒有的抗原決定簇。因此，單一依靠熱處理消除β-Lg致敏性是不夠的。DelValG等（1999）認為分子內(nèi)的二硫鍵對其致敏性有重要影響。于是他們對β-Lg的分子內(nèi)的2個二硫鍵（Cys66-Cys160、Cys106-Cys199）用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷硫氧還原蛋白還原酶（nicotinamideadeninedinucleotidephosphate-thioredoxinreductase）處理，并通過動物模型實驗顯示出，β-Lg的致敏性在一定程度上有所降低，并且可以提高其在胃腸內(nèi)的可消化性。蛋白酶降解也被認為可以消除β-Lg的致敏性。單純用酶解的方法來消除β-Lg的致敏性雖然能取得一定的效果，但是并不能完全解決其致敏性。因為酶解常常不能全部破壞β-Lg分子內(nèi)引起致敏反應(yīng)的部位。SeloI等（1998、1999）為明確β-Lg分子上的某些在致敏反應(yīng)中起決定作用的肽段，通過對β-Lg的限制酶解片段氨基酸組成以及各部分致敏性的分析，得到3個主要的致敏性片段，分別是：f(41-60）、f(102-124）、（149-162）。為使蛋白酶酶解有效破壞這些肽段并消除β-Lg的致敏性，人們對蛋白酶降解方法進行了改進。比如：β-Lg在600MPa下處理10min后經(jīng)胰凝乳蛋白酶或胰酶水解，可以有效去除其致敏性。2.3.2旋糖苷與-lg的組合通過對致敏部位的掩飾可以減少或消除β-Lg引起致敏反應(yīng)的能力。HattoriM等（2000）、KobayashiK等（2001）研究表明：羧甲基右旋糖苷與β-Lg結(jié)合可以有效掩飾β-Lg的致敏部位并能在很大程度上降低β-Lg的抗原性，進而可減少其對嬰兒的致敏作用。并且這種結(jié)合保留了其對脂溶性小分子50%的保持力。某些酸性低聚糖也能起到這種作用。HattoriM等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，褐藻酸低聚糖、磷酸基低聚糖分別以1:6、1:8的比例與β-Lg結(jié)合能顯著降低β-Lg引起機體免疫應(yīng)答的能力，而且所形成的結(jié)合物是可食的，并依然保持了β-Lg對脂溶性小分子的大部分的結(jié)合能力（77%、70%）。1.3.3dkihpfa肽人們還研究了其他消除β-Lg致敏性的方法。TanabeS等（2003）發(fā)現(xiàn)一種酪蛋白源活性肽DKIHPFA，這種肽可以抑制腸道對β-Lg的吸收，進而阻止過敏的發(fā)生。此外，也可以通過從牛乳中分離除去β-Lg的方法來達到這一目的。1.4其它生物活性β-Lg經(jīng)過蛋白酶酶解后產(chǎn)生的一些活性短肽以及β-Lg和其他物質(zhì)形成的復(fù)合物及反應(yīng)產(chǎn)物都有著相當(dāng)重要的生物活性。這些生物活性在保健食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。1.4.1常見的類型化合物類肽由于人們對活性肽研究的范圍逐漸擴大，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些源于β-Lg、有著較強生理活性的肽段，其中有很多是具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）活性的功能短肽。一個研究較多的β-Lg源ACE抑制肽是β-Lg經(jīng)胰蛋白酶酶解后所產(chǎn)生的7肽ALPMHIR(beta-lgf142-148），其半抑制濃度（IC50）為42.6mmolL。VermeirssenV等（2002）研究了ALPMHIR在機體內(nèi)的轉(zhuǎn)運情況。實驗發(fā)現(xiàn)，ALPMHIR能夠在不被降解破壞的狀況下通過小腸上皮細胞層。只要被吸收進機體內(nèi)的這種肽達到一定濃度，其就能對ACE發(fā)揮較強的抑制作用。MaesW等（2004）為進一步研究這種肽的具體功效，特別地將它對ACE的抑制效果與captopril（一種用于治療高血壓的藥物，該藥通過抑制ACE活性起作用）對ACE的抑制效果比較。結(jié)果表明：與空白對照組相比，當(dāng)ALPMHIR濃度為1mmolL時，ET-1的釋放減少了29%(P<0.01),0.1mmolLcaptopril使ET-1釋放減少42%(P<0.01）。除此之外，還有很多具有ACE抑制活性的β-Lg肽。Mullally等（1996）發(fā)現(xiàn)了2種具有ACE抑制活性的β-Lg活性肽，WLLF和HIRL。AbubakarA等（1998）用蛋白酶K在37℃下對乳清蛋白水解6h后產(chǎn)生了1個β-Lg源三肽（IPA），它有著較強的抗高血壓的活性（-31mmHg）。Pihlanto-LeppalaA等（2000）通過幾種蛋白酶對β-Lg進行聯(lián)合水解，也得到了幾種具有ACE抑制活性的肽段。分別是f(22-25）、（32-40）、（81-83）、（94-100）、（106-111）、（142-146）。MurakamiM等（2004）首先發(fā)現(xiàn)1種來自β-Lg的四肽（ALPM）具有較強的ACE抑制活性，并將其命名beta-lactosinB。除了具有ACE抑制活性的β-Lg活性肽以外，還有其他一些生理活性的β-Lg肽被發(fā)現(xiàn)。PellegriniA等（2001）通過酶蛋白對β-Lg進行水解產(chǎn)生了4個具有較強抑菌活性的肽段：VAGTWYf(15-20）、AASDISLLDAQSAPLRf(25-40）、IPAVFKf(78-83）、VLVLDTDYKf(92-100）。NagaokaS等（2001）第一次從β-Lg的胰蛋白酶酶解液中成功的分離出一種五肽IIAEKf(71-75），并通過動物實驗證明此肽有著明顯的降低血清膽固醇水平的作用。它的活性甚至大于beta-谷甾醇（一種降膽固醇藥物）。人們還從β-Lg的胰凝乳蛋白酶水解物分離出1種對某些神經(jīng)受體具有抑制功能的活性肽（beta-LT:HIRL），這種肽起到顯著的鎮(zhèn)靜、止痛、安神的作用。1.4.2干擾hiv、hsv-2、hsv-1的感染β-Lg與羥基鄰苯二甲酸酐（3-hydroxyphthalicanhydrid)(3HP）的結(jié)合所產(chǎn)生的復(fù)合物（3HP-beta-LG）的生物功能較引人注意。經(jīng)研究證明，這種復(fù)合物（3HP-beta-LG）在一定程度上能夠干擾HIV、HSV-2、HSV-1病毒對人體的感染。因為這些病毒都有可供3HP-beta-LG結(jié)合的受體。3HP-beta-LG與這些病毒可以發(fā)生不利病毒感染機體細胞的結(jié)合并降低HIV、HSV-2、HSV-1的感染活性；能夠在一定程度上阻止這些病毒在細胞間的傳播及其與進攻靶的結(jié)合。3HP-beta-LG可以有效地干擾并阻止HIV病毒包膜上的糖蛋白gp120與TH細胞輔受體-CD4的結(jié)合，從而防止了HIV病毒與TH細胞受體結(jié)合后對TH細胞的感染