蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)進展

蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)進展

基因是遺傳信息的紐帶，蛋白質(zhì)是生命活動的執(zhí)行者。實際上每一種生命運動形式,都是特定蛋白質(zhì)群體在不同時間和空間出現(xiàn)并發(fā)揮功能的結(jié)果。因此蛋白質(zhì)組研究是我們理解細胞功能和疾病發(fā)生發(fā)展過程的中心環(huán)節(jié)。如果不能共同致力于蛋白質(zhì)組的研究,那么基因組的研究成果將無法兌現(xiàn)。DNA序列所提供的信息僅僅是一種靜止的資源,而細胞的生命活動是通過各種蛋白質(zhì)來實現(xiàn)的一種動態(tài)過程。一個機體內(nèi)所有不同的細胞都共享同一基因組,然而同一個機體的不同細胞和不同組織卻有不同的蛋白質(zhì)組,而且機體在不同發(fā)育階段,直至最后消亡的全過程中蛋白質(zhì)組也在不斷交化。因此,蛋白質(zhì)組要比基因組復(fù)雜得多。所以,利用基因組的研究成果進行大規(guī)模的蛋白質(zhì)組研究已經(jīng)成為必然。廣泛存在基因組中的冗余性是限制遺傳手段功能基因研究的巨大障礙。而蛋白組學(xué)作為一個技術(shù)手段,不受冗余性限制,這是功能基因研究的有力手段。蛋白質(zhì)組研究需要有足夠的技術(shù)支撐,如雙向凝膠電泳技術(shù),質(zhì)譜分析(MS),酵母雙雜交系統(tǒng),蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)以及能夠進行大規(guī)模數(shù)據(jù)處理的計算機系統(tǒng)和軟件等?，F(xiàn)階段蛋白質(zhì)組的研究可分為3個主要步驟:應(yīng)用雙向凝膠電泳、“雙向”高效柱層析分離蛋白質(zhì);應(yīng)用氨基或組成分析、C-或N-末端氨基或序列分析及質(zhì)譜分析鑒定所分離的蛋白質(zhì);應(yīng)用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫對鑒定結(jié)果進行存儲、處理、對比和分析。雙向電泳技術(shù)是蛋白組學(xué)的基本技術(shù),雙向電泳的成功與否直接關(guān)系到后續(xù)操作。實際工作中蛋白質(zhì)的提取及雙向電泳中的一些關(guān)鍵技術(shù)常常成為得到好的電泳圖譜的制約因素,導(dǎo)致較長時間的重復(fù)操作,耗費大量的人力、物力和財力。筆者在雙向電泳方面積累了一些工作經(jīng)驗,現(xiàn)整理如下,僅供參考。1從樣品中提取蛋白質(zhì)1.1適當(dāng)濃度的蛋白酶抑制劑蛋白質(zhì)的提取是雙向電泳好壞的最關(guān)鍵的因素。只有好的樣品才可能跑出好的電泳圖譜。無論采用何種方法提取何種性質(zhì)的蛋白,千萬不要忘記在所提取緩沖液中加入適當(dāng)濃度的蛋白酶抑制劑(如EGTA,PMSF等),否則不但部分蛋白會丟失,而且很可能在處理和對照的電泳圖譜上造成假的差異點,從而導(dǎo)致嚴(yán)重的錯誤結(jié)果。1.2把樣品轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)在樣品研磨后要轉(zhuǎn)移到離心管中,這也是蛋白丟失的一個關(guān)鍵步驟,因為樣品的研磨一般采用液氮進行,而在轉(zhuǎn)移過程中樣品往往會部分粘在管口而不能完全轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi),筆者的經(jīng)驗是在轉(zhuǎn)移前,先把離心管和轉(zhuǎn)移樣品的用具在液氮中冷凍一下,就能使樣品非常容易的轉(zhuǎn)移進入離心管而不會粘在管口、管壁和轉(zhuǎn)移所用用具上。1.3a.不同聚焦方法樣品中的離子濃度過高會造成雙向電泳的第一向等電聚焦電泳不能很好的聚焦,影響分離效果(如圖1)。所以一般用丙酮來沉淀蛋白清洗離子,清洗時,丙酮中一般要加0.3%的DTT來盡量消除丙酮可能造成的蛋白的甲基化,而且清洗要徹底,一般3次以上。1.4變性劑溶解法溶解的目標(biāo):(1)完全破壞樣品中非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚積體,從而形成各個多肽的溶解液(否則樣品中結(jié)合牢固的蛋白復(fù)合物可能使2-DE中出現(xiàn)新的蛋白點,相應(yīng)的表示單個多肽的點的強度會下降);(2)溶解方法必須去除可能干擾2-DE分離的鹽、脂類、多糖和核酸等物質(zhì);(3)溶解方法要保證樣品在電泳過程中保持溶解狀態(tài)。變性劑可通過改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展,將其疏水中心完全暴露,降低接近疏水殘基的能量域。其典型代表是尿素和硫脲。表面活性劑經(jīng)過變性劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團后,還常需要至少一種表面活性劑來溶解疏水基團。常用的表面活性劑有離子去污劑SDS、非離子去污劑TritonX-100和NP-40、兩性離子去污劑CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。在變性劑和表面活性劑聯(lián)用條件下,加用還原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開更完全,溶解更徹底。常用含自由巰基的DTT或b-巰基乙醇,以及不帶電荷的三丁基膦(TBP)進行還原。推薦使用的蛋白溶解液是:7M尿素,2M硫脲,2%CHAPS,1%DTT和2%兩性電解質(zhì)。1.5樣品儲存蛋白質(zhì)溶解后,可于-20℃保存,一定注意不能反復(fù)凍溶,否則會造成蛋白的降解。2人才培養(yǎng)時間的確定聚焦步驟可根據(jù)不同的樣品選擇,一般采用所選IPG干膠條的說明再結(jié)合實驗進行選擇。對于聚焦時間,理論上講,要獲得最好的圖譜質(zhì)量和重復(fù)性所需最佳時間是IEF分離達到穩(wěn)定態(tài)所需的時間。聚焦時間太短,會導(dǎo)致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。過度聚焦雖然不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)向陰極漂移,但會因為活性水轉(zhuǎn)運而導(dǎo)致過多水在IPG膠表面滲出(電滲)而造成蛋白圖譜變性,在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白丟失(圖2,3)。3維電泳膠條的平衡一維結(jié)束后可馬上進行二維電泳,也可保存在兩片塑料膜間于-80℃保存數(shù)月。但在二維電泳前一定要進行膠條的平衡,以便于被分離的蛋白質(zhì)與SDS完整結(jié)合,從而在SDS上電泳能順利進行。一般進行兩次平衡,先用DTT平衡,再用碘代乙酰胺進行二次平衡取消DTT的影響。4第二向電泳：sds-頁面4.1灌膠的制作進行SDS時,使用預(yù)制膠方便、快捷且重復(fù)性好。但由于價格昂貴,現(xiàn)在大部分實驗室還是自己灌膠,如果方法掌握得好是能得到很好效果的。但必須指出的是,灌制膠時,膠面一定要平,否則第一向的膠條不能很好的和膠面接觸,影響電泳效果。所以放置灌膠模具的桌面一定要平。4.2兩膠之間不能有氣泡把第一向的膠條放置在第二向的膠面上后,一定要保證兩膠之間不能有氣泡,否則有氣泡部分的蛋白不能很好的分離。解決氣泡的方法是可以把剪成尖角的濾紙慢慢趕走,但注意不要損傷膠條,以避免膠上蛋白的丟失。4.3密封密封液的用途是把膠條和第二向的膠很好的結(jié)合起來,而且密封液中的溴酚藍在電泳中起指示作用。但密封液不能加的太多,以剛剛蓋