熒光法對(duì)藥物與血清白蛋白相互作用的研究進(jìn)展

熒光法對(duì)藥物與血清白蛋白相互作用的研究進(jìn)展

藥物分子與血清闡明劑相互作用的研究是化學(xué)和科學(xué)之間的邊緣性課題之一。從化學(xué)研究的角度來看，血清闡明劑與藥物的結(jié)合反應(yīng)主要包括結(jié)合位置、結(jié)合數(shù)、結(jié)合常數(shù)、相互作用類型、共存物質(zhì)的影響、藥物在血液中的分配等。采用的研究方法包括熒光法、平衡分析法、圓二色譜法、紫外色譜法和色譜法。利用熒光法研究藥物分子和蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)，可以充分利用蛋白質(zhì)和藥物的信息。還可以考慮實(shí)驗(yàn)條件的影響，如化合物突然死亡、熒光過敏、能量轉(zhuǎn)移和實(shí)驗(yàn)條件。1內(nèi)容和方法的研究1.1藥物在血清白蛋白上的結(jié)合部位血清白蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)已探明,有3個(gè)類似的結(jié)構(gòu)域:SiteⅠ,SiteⅡ和SiteⅢ.每個(gè)結(jié)構(gòu)域又含有A與B2個(gè)亞結(jié)構(gòu)域,以槽口相對(duì)的方式形成圓筒狀結(jié)構(gòu).大多數(shù)藥物在血清白蛋白上的結(jié)合部位為SiteⅠ及SiteⅡ.用熒光法確定藥物分子在血清白蛋白上的結(jié)合部位常用以下方法.1.1.1平臺(tái)內(nèi)治療某些熒光探針對(duì)蛋白質(zhì)不同區(qū)域有特異性的結(jié)合,根據(jù)藥物加入后對(duì)熒光探針的影響可以確定藥物結(jié)合部位.已知SiteⅠ的探針有:華法令(Warfarin),苯基保泰松(phnylbutazone),丹磺酰胺(dansylamide)等;SiteⅡ的探針有:布洛芬(ibuprofen),氯滅酸(flufenamicacid)等.1.1.2能量轉(zhuǎn)移作用的藥物與色氨酸殘基的距離與藥物與色氨酸殘基的距離計(jì)算蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要是色氨酸發(fā)出的.利用Froster能量轉(zhuǎn)移理論,可以求出和蛋白質(zhì)作用的藥物與色氨酸殘基之間的距離,由此推測藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合的空間部位.能量轉(zhuǎn)移作用可以發(fā)生在藥物蛋白質(zhì)復(fù)合物內(nèi)部,也可以發(fā)生在藥物與蛋白質(zhì)分子之間.在后一種情況時(shí),求得的藥物與色氨酸殘基之間的距離表示分子擴(kuò)散過程中藥物分子與色氨酸殘基的最近距離.1.2蛋白質(zhì)溶液內(nèi)源熒光變化Scatchard作圖法是研究生物大分子與有機(jī)小分子結(jié)合反應(yīng)的經(jīng)典方法.此法在應(yīng)用時(shí)須知道反應(yīng)體系中游離態(tài)藥物的濃度,這一點(diǎn)用熒光法測定時(shí)常不易做到,而且Scatchard作圖法所得結(jié)果往往不理想;因此,在研究藥物分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)中,Scatchard作圖法應(yīng)用不多.張保林等曾用此法研究了蒽醌及黃酮類化合物與人血清白蛋白的結(jié)合反應(yīng).蛋白質(zhì)與藥物分子發(fā)生反應(yīng)時(shí),可引起體系熒光性質(zhì)的改變,有2種情況:1)藥物分子無熒光,在蛋白質(zhì)溶液中加入藥物后,蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光被猝滅;2)藥物分子有熒光,蛋白質(zhì)與藥物混合后,其內(nèi)源熒光被猝滅,同時(shí)藥物分子的熒光被敏化增強(qiáng).從熒光猝滅機(jī)理上來看,藥物分子對(duì)蛋白質(zhì)熒光的猝滅可分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅.動(dòng)態(tài)猝滅是藥物和蛋白質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用而導(dǎo)致的熒光猝滅,遵循SternVolmer方程:F0/F=1+KsvcQ.(1)式中F0為未加藥物(猝滅劑)時(shí)蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度,F表示加入藥物濃度為cQ時(shí)蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度,Ksv稱為猝滅常數(shù).靜態(tài)猝滅是藥物和蛋白質(zhì)在基態(tài)時(shí)生成復(fù)合物,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)熒光強(qiáng)度降低.對(duì)于1∶1結(jié)合的情況,可推導(dǎo)出公式:F0/F=1+K[Q].(2)式中K為復(fù)合物的穩(wěn)定常數(shù),[Q]為游離藥物分子的濃度.根據(jù)此式作F0/F～[Q]圖,可由回歸直線斜率求得K值.用式(2)作圖,發(fā)現(xiàn)所得回歸直線往往線性關(guān)系不好,為此,將式(2)變形為雙倒數(shù)公式,該式是目前國內(nèi)作者引用最多的一個(gè)公式.(F0-F)-1=F0-1+K-1F0-1[Q]-1.(3)對(duì)于多結(jié)合位點(diǎn)的情況,張勇等提出了一個(gè)求取結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的線性回歸公式:lg(F0-F)/F=lgK+nlg[Q],(4)但此式應(yīng)用不多.此外,易平貴等也提出了求算結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和穩(wěn)定常數(shù)的公式,應(yīng)用亦不多.1.3要作用類型藥物與蛋白質(zhì)間的作用力屬于分子間的弱相互作用,包括氫鍵、范德華力、靜電引力和疏水力.根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)焓變?chǔ)和熵變?chǔ)的相對(duì)大小,可以判斷藥物與蛋白質(zhì)之間的主要作用力類型:ΔH>0,ΔS>0為疏水作用力;ΔH<0,ΔS<0為氫鍵和范德華力;ΔH≈0,ΔS>0為靜電引力.在溫度變化不大時(shí),反應(yīng)的焓變?chǔ)可以看作一個(gè)常數(shù).由穩(wěn)定常數(shù)可以求出反應(yīng)的自由能變?chǔ).ΔG=-RTlnK,(5)然后根據(jù)下式分別求出ΔH和ΔS:lgK2K1=(1T1?1T2)ΔHR?(6)ΔG=ΔH?TΔS.(7)lgΚ2Κ1=(1Τ1-1Τ2)ΔΗR?(6)ΔG=ΔΗ-ΤΔS.(7)應(yīng)當(dāng)指出,血清白蛋白結(jié)構(gòu)很復(fù)雜,它和藥物之間往往同時(shí)存在幾種作用力.1.4肌肉蛋白構(gòu)象的熒光表征血清白蛋白在溶液中存在同分異構(gòu)體.pH在4.5～7.5之間為N型,pH在4.5～3.0之間轉(zhuǎn)變?yōu)椴糠炙崤蛎汧構(gòu)象,pH>8時(shí)為另一種膨脹的B構(gòu)象.3種構(gòu)象能可逆轉(zhuǎn)換.利用同步熒光可以了解藥物分子對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響.由Δλ=15nm所作出的同步熒光光譜只顯示酪氨酸殘基的光譜特性;而由Δλ=60nm的同步熒光光譜僅表現(xiàn)色氨酸殘基的熒光.因氨基酸殘基的最大吸收波長與其所處環(huán)境的極性有關(guān),故而由發(fā)射波長的改變可判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化.發(fā)射波長紅移表明氨基酸殘基所處環(huán)境的極性增加,藍(lán)移則疏水性增加.通常作色氨酸殘基的同步熒光光譜,以此判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化.當(dāng)色氨酸殘基位于疏水性介質(zhì)中時(shí),λmax=331nm;部分位于疏水性介質(zhì)中時(shí),λmax=341nm;完全暴露于水相時(shí),λmax=351nm.1.5血清白蛋白與藥物的結(jié)合常數(shù)能與血清白蛋白結(jié)合的共存物質(zhì)會(huì)影響藥物與蛋白的結(jié)合.如金屬離子與藥物競爭的結(jié)果,減小了血清白蛋白與藥物的結(jié)合常數(shù),一般減小30%～60%;但有些共存物質(zhì)(如Cu2+?,Fe2+?等)的存在會(huì)提高某些藥物與血清白蛋白的結(jié)合常數(shù).此外,實(shí)驗(yàn)條件(如濃度、酸度、離子強(qiáng)度和溶劑)也會(huì)不同程度地影響藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合.2主要研究結(jié)果國外對(duì)藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)研究較早.國內(nèi)化學(xué)工作者在這方面的研究有十余年的歷史.表1總結(jié)了近年來國內(nèi)作者在這方面的主要研究結(jié)果.3游離藥物分子檢測利用熒光法研究藥物與血清白蛋白反應(yīng)時(shí),某些藥物在血清白蛋白的熒光激發(fā)波長和發(fā)射波長處有吸收,會(huì)影響熒光強(qiáng)度的測量,這就是所謂的內(nèi)濾光效應(yīng).文獻(xiàn)提出了熒光校正方法.利用公式(2),(3)和(4)求算結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和結(jié)合常數(shù)要求知道游離藥物分子的濃度[Q],這一數(shù)值往往不易得知,計(jì)算中多利用藥物的總濃度代替[Q]作圖,這樣勢必帶來誤差.今后應(yīng)做的工作主要有:1)在藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合機(jī)理與結(jié)合區(qū)域方面應(yīng)進(jìn)一步研究