薏苡仁多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響

薏苡仁多糖對(duì)實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響

到目前為止，2型糖尿病與遺傳和肥胖引起的胰島素敏感性降低有關(guān)。這種表現(xiàn)是多方面的，胰島素阻力是其顯著特征。我們?cè)?jīng)觀察了薏苡仁多糖(coixan)能顯著降低正常及高血糖模型小鼠的血糖;Coixan對(duì)四氧嘧啶致大鼠胰島β細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用。在此基礎(chǔ)上我們用小劑量鏈脲佐菌素(STZ)加高熱量飼料喂養(yǎng)建立了實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠模型,觀察了Coixan對(duì)該模型大鼠IR的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。材料和方法一、中微量元素和糖原Coixan(由我院臨床藥理基地提取,經(jīng)鑒定是由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、乳糖、葡萄糖組成的多聚糖,分子量為1.5×104)用蒸餾水配制成2%溶液;鏈脲佐菌素(STZ,用前溶于0.1mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,pH4.4)(Sigma公司);中分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)(BSA)、PMSF、EDTA、PEG、Cysteine(Sigma公司);125I-胰島素和胰島素測(cè)定試劑盒(華西糖尿病研究所);糖原標(biāo)準(zhǔn)(第二軍醫(yī)大學(xué)朝暉制藥廠);其它試劑均為分析純。二、方法1.造模、分組、給藥健康Wistar大鼠(清潔級(jí)),雄性,體重200～250g(由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),自由飲水進(jìn)食,隨機(jī)分為正常對(duì)照組(N),造模組,按如下方法建立模型,造模成功后再將模型動(dòng)物隨機(jī)分為模型對(duì)照組(C),薏苡仁多糖低(L)、中(M)、高(H)劑量治療組,連續(xù)給藥2周。2.基礎(chǔ)飼料的選擇Wistar大鼠實(shí)驗(yàn)前先適應(yīng)性喂養(yǎng)三天,禁食24h后,造模組尾靜脈注射STZ25mg/kg體重,正常對(duì)照組則注射等體積的檸檬酸緩沖夜,均用基礎(chǔ)飼料(總熱量15.335J/g、碳水化合物53%、蛋白質(zhì)20%、脂肪9%)喂養(yǎng)2周后,造模組挑選葡萄糖耐量異常大鼠改用高熱量飼料(由基礎(chǔ)飼料加蔗糖、煉豬油等混合而成,總熱量20.083J/g、碳水化合物51%、蛋白質(zhì)15%、脂肪25%)。正常對(duì)照組仍給予基礎(chǔ)飼料,持續(xù)喂養(yǎng)10周,實(shí)驗(yàn)期間觀察動(dòng)物體重、飲食及尿量。3.對(duì)胰島素、脂肪酸和葡萄糖的抗測(cè)量每次取標(biāo)本前均禁食12h,血糖測(cè)定采用血糖儀法,胰島素測(cè)定采用放免法,乳酸測(cè)定按潘瑾方法進(jìn)行。4.tpsf-rosf法參考MadhurK等方法稍加改進(jìn)。大鼠處死后,立即取出肝臟,在冰浴上去除結(jié)締組織,用冷生理鹽水洗凈血污,稱重。按1:10(W/V)要求加入適量預(yù)冷緩沖液A(50mmol/LTris-HCl溶液pH7.4,含250mmol/L蔗糖、1mmol/LPMSF,1mmol/LEDTA)剪碎,用內(nèi)切式組織勻漿器打碎,再用玻璃勻漿器勻漿,200目尼龍布過濾,收集濾液。于4℃,10000×g離心10min,棄沉淀,上清液再于4℃,10000×g離心60min,棄上清,沉淀懸浮于緩沖液B(500mmol/LTris-HCl溶液pH7.4)中。膜蛋白定量用Lowry法,以BSA作標(biāo)準(zhǔn),調(diào)節(jié)蛋白濃度為4ug/ul,-30℃貯存?zhèn)溆谩?.肝細(xì)胞質(zhì)類固醇輻射配體分析參照Talor等方法。6.koh-苯酚法取大鼠右側(cè)后肢肌肉和肝臟,置-35℃冰箱備用,一周內(nèi)測(cè)定。糖原測(cè)定參考Lo等的方法稍作修改,稱取100mg左右的組織,置于150mm×20mm試管中,加入Na2SO4飽和的30%KOH溶液0.75ml,100℃水浴30min至變成淡黃色透明液體,冰浴中冷卻,再加入95%乙醇0.9ml,提取糖原,再次冰浴30min,840×g離心20min,棄上清,沉淀用1ml重蒸水溶解后加入5%苯酚溶液1ml,搖勻后再迅速(10sec內(nèi))加入97%H2SO42.5ml靜置10min后,搖勻,25℃水浴15min,以蒸餾水為空白,495nm波長(zhǎng)比色。7.葡萄糖激酶活性測(cè)定—肝葡萄糖激酶活性測(cè)定:動(dòng)物處死后立即取肝臟用冷0.15MKCL、1mMEDTA溶液洗后,稱重,按1:2(W/V)加入冰冷0.1MTris-HCl(含有0.01Mcysteine,1mMEDTA)pH7.4緩沖液在玻璃勻漿器中勻漿,然后4℃20000×g離心20min,取上清液作葡萄糖激酶活性測(cè)定。8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理胰島素受體結(jié)合分析數(shù)據(jù)采用本?！吧萄惺揖幹啤彪p位點(diǎn)受體計(jì)算機(jī)軟件程序處理,其它數(shù)據(jù)選用本校數(shù)學(xué)教研室編制的《醫(yī)用統(tǒng)計(jì)程序包SPMR》的相應(yīng)程序處理,數(shù)據(jù)以ˉx±sxˉ±s表示,P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性。結(jié)果一、各組大鼠血糖情況造模組大鼠STZ尾靜脈注射及喂飼高熱量飼料10周后,表現(xiàn)出活動(dòng)減少,飲水量及尿排泄量明顯增多,體重增長(zhǎng)(313.8±22.9)明顯高于N組大鼠(276.3±15.2)(P<0.01),經(jīng)Coixan治療后,各組以上情況明顯好于C組。大鼠處死前各組葡萄糖耐量試驗(yàn)結(jié)果見表1,各組空腹血糖值無顯著性差異(P>0.05),糖負(fù)荷后30min、60min、120min時(shí)相點(diǎn)的血糖值C組明顯高于N組(P<0.01),L組、M組各時(shí)相點(diǎn)的血糖雖高于N組時(shí)相點(diǎn)的血糖(P<0.05),但低于C組各時(shí)相點(diǎn)的值(P<0.05)。而H組各時(shí)相點(diǎn)的血糖明顯低于C組(P<0.01),基本上與N組的接近(P>0.05)。以上結(jié)果表明,Coixan能夠改善實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠糖耐量異常,且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。二、各組大鼠血漿胰島素水平各組大鼠血漿胰島素及乳酸水平見表2。C組大鼠胰島素及乳酸明顯高于N組(P<0.01),說明實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠存在高胰島素血癥和非氧糖代謝異?；钴S的狀況。經(jīng)Coixan治療后,L組、M組、H組大鼠血漿胰島素均低于C組,但差異不顯著(P>0.05),且明顯高于N組(P<0.01),而治療各組乳酸水平低于C組(P<0.05),其中H組與N組的值接近(P>0.05)。由此可見,Coixan的治療不改變實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠的血漿胰島素水平,但可明顯降低其血漿乳酸水平,且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。三、各組受體的結(jié)合率肝細(xì)胞膜胰島素受體結(jié)合試驗(yàn)經(jīng)Scatchard分析結(jié)果見表3。N組肝細(xì)胞膜胰島素受體最大結(jié)合率為12.96±0.77%,受體最大結(jié)合容量為1.12±0.62pmol/mg蛋白。與N組相比,C組受體最大結(jié)合率為11.32±1.68%,變化不大(P>0.05),而受體最大結(jié)合容量下降49.11%,差異非常顯著性(P<0.01)。Coixan治療各組受體最大結(jié)合率及受體最大結(jié)合容量與C組相比均無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果說明實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠肝細(xì)胞膜胰島素受體最大結(jié)合容量顯著下降,Coixan對(duì)胰島素受體最大結(jié)合率及受體最大結(jié)合容量均無影響。四、基本概念2.造林如表4,N組肝、肌糖原值分別為567.98±38.18、276.36±37.42ug/g濕重,C組其相應(yīng)的肝、肌糖原量分別比N組的下降了28.92%、24.96%(P<0.01)。經(jīng)Coixan治療的L組肝、肌糖原量增加到496.29±29.72、224.73±25.92ug/g濕重,肝糖原量增加顯著(P<0.05),與C組相比,M組、H組肝糖原增加的幅度分別為30.82%、34.18%(P<0.01),肌糖原增加的幅度分別為15.69%、16.84%(P<0.05)。結(jié)果表明,Coixan能夠增加實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠肝、肌糖原的儲(chǔ)存,特別是肝糖原的儲(chǔ)存,且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。五、肝葡萄糖激酶活性變化各組大鼠肝葡萄激酶活性結(jié)果見表5。N組大鼠肝葡萄糖激酶活性為100±4%,與之相比,C組的為86±9%,其活性明顯減弱(P<0.05)。經(jīng)Coixan治療后,L組、M組、H組肝葡萄糖激酶活性比C組的分別上升了31.4%、53.49%、119.77%(P<0.01)。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠肝葡萄糖激酶活性明顯降低,Coixan能夠顯著提高其活性。型糖尿病大鼠血糖及胰島素受體結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠是利用低劑量的STZ部分破壞胰島細(xì)胞,然后輔以高熱量飼料喂養(yǎng)讓動(dòng)物發(fā)胖而建立的一種動(dòng)物模型。據(jù)報(bào)道,該動(dòng)物模型不同于用大劑量的STZ或四氧嘧啶建立的1型糖尿病動(dòng)物模型,除了表現(xiàn)有明顯的血糖升高、糖耐量異常等代謝紊亂,還觀察到該模型大鼠血胰島素以及血甘油三酯、膽固醇水平均明顯升高和LDL-膽固醇、過氧化脂質(zhì)增高的現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)所建立的2型糖尿病大鼠模型結(jié)果顯示,除了糖耐量異常及血胰島素升高外,血乳酸亦明顯高于正常對(duì)照組,而且還存在有肝、肌、糖原儲(chǔ)存減少,肝細(xì)胞膜胰島素受體最大結(jié)合容量明顯降低以及葡萄糖激酶活性降低。表明實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠出現(xiàn)了明顯糖代謝紊亂和以高血糖、高血脂、高胰島素血癥為特征的IR。有研究報(bào)道實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠紅細(xì)胞胰島素受體結(jié)合下降,并且認(rèn)為這種下降與IR相關(guān),應(yīng)用相關(guān)的藥物治療后血胰島素水平降低,紅細(xì)胞胰島素受體結(jié)合力恢復(fù)正常。Knutson等指出2型糖尿病中胰島素受體結(jié)合力一般沒有改變,因而推測(cè)受體結(jié)合力的下降主要與胰島素受體數(shù)目減少有關(guān)。我們的研究證實(shí):實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠肝細(xì)胞膜胰島素受體最大結(jié)合率無顯著變化,而胰島受體最大結(jié)合容量明顯降低。因此我們認(rèn)為實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠肝細(xì)胞膜胰島素受體最大結(jié)合容量的減少可能是由于大鼠機(jī)體高血糖、高胰島素血癥反應(yīng)所引起的受體向下調(diào)節(jié)(downregulation),結(jié)果使細(xì)胞表面單位面積受體數(shù)目減少所致,肝細(xì)胞膜胰島素受體數(shù)目的改變不是該大鼠模型IR的主要原因。Coixan既沒有改變大鼠肝細(xì)胞膜胰島素受體的最大結(jié)合率,也沒有增加胰島素受體最大結(jié)合容量,說明Coixan增加外周組織糖代謝,改善IR不是在胰島素受體水平而可能涉及對(duì)受體后細(xì)胞內(nèi)不同調(diào)節(jié)物的作用。cAMP是胰島素的第二信使之一,2型糖尿病紅細(xì)胞及腦組織cAMP胰島素受體結(jié)合力下降的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,提示糖、脂代謝障礙可能與胰島素受體后細(xì)胞內(nèi)不同調(diào)節(jié)物的缺失有關(guān)。2型糖尿病高血糖的產(chǎn)生主要是由于葡萄糖的產(chǎn)生和輸出增加,而外周組織對(duì)葡萄糖的利用減少,Thorbuvn等證實(shí)2型糖尿病胰島素刺激的葡萄糖代謝途徑存在有缺陷,組織酶活性測(cè)定顯示胰島素刺激脫氫酶、肌內(nèi)糖原合成酶和糖原合成酶磷酸化酶的作用在2型糖尿病中均降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠糖原分解增多,合成減少,糖異生活躍,糖酵解受