薏苡仁多糖提取工藝優(yōu)化及其凝膠柱層析特性研究

薏苡仁多糖提取工藝優(yōu)化及其凝膠柱層析特性研究

愛(ài)斯基亞是英國(guó)的名字叫托吡西亞。這是水稻科的一種干燥成熟的種子。它也被稱(chēng)為“皇家海軍”、“回回米”和“六谷米”?！侗静菥V目》中提及薏苡仁“健脾益胃、補(bǔ)肺清熱、祛風(fēng)勝溫、強(qiáng)筋骨”。薏苡在我國(guó)大部分地區(qū)均有種植,主要產(chǎn)于福建、河北、遼寧等地。國(guó)內(nèi)對(duì)薏苡仁的開(kāi)發(fā)利用極為重視,我國(guó)主要對(duì)薏苡仁酯做了大量研究工作,并且已經(jīng)被康萊特公司研制成抗腫瘤的注射液等產(chǎn)品,在臨床上以得到廣泛應(yīng)用,提取薏苡仁油以后的殘?jiān)壷挥没蛴米黠暳稀＾曹尤手泻休^多的多糖,目前對(duì)薏苡仁多糖提取分離純化研究較少且多糖的得率不高。其多糖已被證實(shí)具有降血糖、提高免疫力等作用。本實(shí)驗(yàn)以提油后的薏苡仁渣為原料進(jìn)行多糖的提取和分離純化的初步研究,一方面旨在提高薏苡仁的綜合利用,另一方面為薏苡仁多糖的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供更多的參考數(shù)據(jù)。1材料和方法1.1各組分的分析純薏苡仁(產(chǎn)地:浙江)南昌匯仁集團(tuán)有限公司。石油醚(60~90℃)、丙酮、乙醚、95%乙醇、苯酚、濃硫酸、葡萄糖、氯仿、正丁醇、30%雙氧水、NaOH、濃HCl、淀粉酶、糖化酶、DEAE-52、SephadexG-75等(均為分析純)。1.2儀器、儀器和儀器B-260恒溫水浴鍋上海亞龍生化儀器廠;電子天平上海良平儀器儀表有限公司;KQ5200超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵鞏義市予華儀器有限責(zé)任有限公司;RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞龍生化儀器廠;GZX-DH-40X-45S電熱恒溫干燥箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;JB-3磁力攪拌器上海電磁新涇儀器有限公司。1.3椰子糖提取技術(shù)的優(yōu)化1.3.1椰子糖提取工藝薏苡仁→篩選→粉碎→脫脂→熱水提取→離心→上清液→濃縮→醇沉→干燥→薏苡仁粗多糖1.3.2提取淀粉的制備挑選籽粒飽滿(mǎn)、色澤潔白、無(wú)蟲(chóng)蛀、無(wú)霉斑的薏苡仁充分干燥后置于超微粉碎機(jī)中,粉碎過(guò)篩。每份稱(chēng)取5g,用石油醚脫脂后,置于三角瓶中,加蒸餾水調(diào)節(jié)pH5.2,于100℃水浴鍋中提取。按20IU/g加淀粉酶到提取液中,直到碘檢不變色;接著按18IU/g加糖化酶,水浴溫度50~60℃,pH6.5處理1h,以去除淀粉。100℃水浴條件下滅酶10min,然后在3000r/min下離心10min,上清液經(jīng)減壓濃縮,加入4倍濃縮液體積的95%乙醇醇沉過(guò)夜,干燥沉淀得薏苡仁粗多糖。1.3.3u3000解決文獻(xiàn)取苯酚100g,加鋁片0.1g和碳酸氫鈉0.05g,常壓蒸餾,收集182℃餾分。稱(chēng)取該餾分5g,置100mL容量瓶中,加蒸餾水至刻度,搖勻后,置棕色試劑瓶中,冰箱中冷藏儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.3.3.對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取80℃干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖10mg于100mL容量瓶中,加水至刻度,搖勻即為質(zhì)量濃度為0.1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作液。精密量取葡萄糖對(duì)照品溶液(0.1mg/mL)0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mL分別置于干燥試管中,各加水至1.00mL,再分別加苯酚試劑0.50mL,搖勻,在冷水浴中迅速滴加硫酸2.50mL,即刻搖勻后放置10min,然后放置沸水浴加熱10min,迅速冷卻到室溫。以1.0mL蒸餾水按同樣顯色操作為空白,于488nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值,以橫坐標(biāo)為葡萄糖質(zhì)量、縱坐標(biāo)為吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.3.3.多糖含量的測(cè)定精確稱(chēng)取60℃干燥至質(zhì)量恒定的實(shí)驗(yàn)室精制薏苡仁多糖10mg,水溶解后定容到100mL容量瓶中,搖勻,作為多糖儲(chǔ)備液。精確量取多糖儲(chǔ)備液1mL,定容至l0mL,取0.5mL加水至1mL,按測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣的方法測(cè)其吸光度。按下式計(jì)算換算因子:式中:m為多糖質(zhì)量/mg;C為多糖液中葡萄糖的質(zhì)量濃度/(mg/mL);D為多糖的稀釋因子。1.3.3.4-椰子糖的計(jì)算提取液按上述操作顯色,測(cè)得吸光度,由葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線查得多糖質(zhì)量,并換算多糖得率。1.3.4正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)在全面考察提取溫度、時(shí)間、pH值、提取次數(shù)、料液比、原料粉碎度的基礎(chǔ)上,選擇提取時(shí)間、提取溫度、料液比3項(xiàng)為考察因素,各取3個(gè)水平,正交因素水平表(表1),進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。1.4杏仁糖的分離和提取1.4.1精制薏養(yǎng)殖仁多糖薏苡仁粗多糖→脫脂→Sevag法脫蛋白→H2O2脫色→透析→DEAE-52柱層析→SephadexG-75凝膠柱層析→精制薏苡仁多糖1.4.2薏養(yǎng)殖仁多糖的制備精確稱(chēng)取粗多糖5g,溶于30mL蒸餾水中配成粗多糖溶液,在粗多糖液中加入(4倍體積)120mL的無(wú)水石油醚,振蕩后,靜置1h,溶液分為上下兩層,除去上層石油醚層,下層水溶液按上述步驟重復(fù)3次,最后得到脫脂的薏苡仁多糖液。1.4.3離心條件下的上清液重復(fù)處理在粗多糖液中加入1/5體積的Sevag試劑(氯仿:正丁醇=4:1),劇烈振蕩30min,3000r/min離心20min取上清液,除去水與有機(jī)相間的變性蛋白層,上清液再按上述步驟重復(fù)處理5次,至氯仿與水層之間無(wú)白色膠狀物產(chǎn)生。最后得到脫蛋白的薏苡仁多糖液,減壓濃縮至一定體積,加入4倍體積95%乙醇醇沉,靜置澄清后傾去上清液,然后再加少量蒸餾水溶解,再醇沉,如此重復(fù)3次,以除去Sevag試劑。1.4.4脫衣舞脫蛋白后的薏苡仁多糖水溶液以濃氨水(或NaOH溶液)調(diào)至pH8.0,滴加30%H2O2至淺黃色,于50℃水浴保溫2h。1.4.5分離膜的制備用截留相對(duì)分子質(zhì)量為7000~14000的透析袋,流水透析2d,再以蒸餾水透析1d。單糖、雙糖及無(wú)機(jī)鹽等小分子物質(zhì)可以透出膜外,而所要的薏苡仁多糖被截留在膜內(nèi),從而達(dá)到對(duì)多糖純化的目的。將多糖溶液濃縮,并定容至25mL備用。1.4.6洗脫曲線檢測(cè)DEAE-52纖維素粉→充分溶漲→漂洗3次→1mol/LNaOH溶液浸泡1h→蒸餾水洗至中性→1mol/LHCl溶液浸泡1h→蒸餾水洗至中性→1mol/LNaOH溶液浸泡1h→蒸餾水洗至中性→裝柱→平衡→加樣1mL→以蒸餾水洗脫(5mL/管,收集30管)→苯酚-硫酸法檢測(cè)得洗脫曲線1.4.7洗脫曲線的測(cè)定SephadexG-75粉→充分溶漲→漂洗3次→1mol/LNaOH溶液浸泡1h→蒸餾水洗至中性→裝柱→平衡→加樣1mL→分別以蒸餾水、0.1mol/LNaCl溶液、0.3mol/LNaCl溶液為洗脫液洗脫(5mL/管,收集30管)→苯酚-硫酸法檢測(cè),得到三條洗脫曲線→分別合并高峰部分備用1.5紫外分光光度法的純度分別取5mL上述純化后的薏苡仁多糖溶液,于200~400nm區(qū)間進(jìn)行紫外光譜掃描,觀察在260、280nm處是否有吸收。2結(jié)果與分析2.1特性與多糖含量的關(guān)系經(jīng)實(shí)驗(yàn)得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0177X-0.0151(相關(guān)系數(shù)R2=0.9993)。回歸分析表明,在10~50μg/mL范圍內(nèi)葡萄糖的質(zhì)量與吸光度呈良好線性關(guān)系。將薏苡仁粗多糖樣品溶解到水中,稀釋至合適濃度,按此方法測(cè)定多糖含量。實(shí)驗(yàn)測(cè)得換算因子f=0.1236。2.2提取溫度及時(shí)間如表2所示,試驗(yàn)中各影響因素的主次順序如下:B(提取溫度)>C(料液比)>A(提取時(shí)間)。正交試驗(yàn)所得最佳工藝為A3B3C1,按此工藝提取薏苡仁多糖,多糖得率為5.53%(n=3)。2.3杏仁糖的分離和提取2.3.1層析洗脫曲線以蒸餾水為洗脫液,得薏苡仁多糖的DEAE-52柱層析洗脫曲線,如圖1所示,只有一個(gè)單一的主峰。經(jīng)DEAE-52柱層析,既可以進(jìn)一步除去色素,又能除去其他雜質(zhì),干燥得到的薏苡仁多糖為白色固體。2.3.2洗脫溶劑的選擇薏苡仁多糖的SephadexG-75凝膠柱層析特性的考察,分別以蒸餾水、0.1mol/LNaCl溶液、0.3mol/LNaCl溶液為洗脫液洗脫(5mL/管,收集30管),苯酚-硫酸法檢測(cè),得到以上3條洗脫曲線,結(jié)果如圖2所示。3個(gè)峰形圖大致相同,以0.1mol/LNaCl溶液作為洗脫液的洗脫效果最佳。該洗脫曲線型特征為薏苡仁多糖研究提供了初步質(zhì)量指標(biāo)之一。2.4成品的譜掃描結(jié)果由不同洗脫液得到的薏苡仁多糖的紫外光譜掃描結(jié)果(圖3)可以看出,在260nm和280nm處均無(wú)吸收峰,證明純化后的薏苡仁多糖中不含核酸和蛋白質(zhì)。3結(jié)論1.3.3.超聲溫度和提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響3.1薏苡仁多糖提取工藝優(yōu)化結(jié)果表明,其最佳工藝條件為料液比1:15、提取溫度100℃、提取時(shí)間150min。提取溫度是影響多糖得率的最主要因素,薏苡仁多糖主要存在于胚乳細(xì)胞的細(xì)胞壁中,在一定的溫度范圍內(nèi),較高的提取溫度利于胚乳細(xì)胞壁破碎而使多糖溶出。隨著溫度的提高,多糖得率也逐漸增加,溫度100℃時(shí)多糖得率最高。料液比影響次之,提取時(shí)間在3個(gè)因素中對(duì)多糖得率影響最小,故在工業(yè)化生產(chǎn)中,考慮成本及工序問(wèn)題,可適當(dāng)縮短提取時(shí)間。在最佳條件下多糖得率為5.53%,與以往的報(bào)道相比條件適宜且多糖的得率有所提高。3