穩(wěn)定干擾p53基因?qū)Ρ茄拾﹉sp27、14-3表達(dá)譜的影響

穩(wěn)定干擾p53基因?qū)Ρ茄拾﹉sp27、14-3表達(dá)譜的影響

癌癥（iu）是一種常見的腫瘤之一，發(fā)生在東南亞和中國南方的省會和省份。根據(jù)疾病的病因研究，腫瘤的發(fā)生與厭氧感染、遺傳易感性、飲食習(xí)慣和一些環(huán)境因素有關(guān)。這是多基因、多路徑、多階段變化的病理過程，以及多基因、多階段入侵的疾病。p53基因是極為重要的抑瘤基因,具有阻滯細(xì)胞周期、啟動細(xì)胞凋亡、維持基因組穩(wěn)定性的作用.50%以上人類腫瘤的發(fā)生存在p53基因高頻率突變失活,但在鼻咽癌中p53基因突變頻率低于10%.大量的研究顯示:60%以上的鼻咽癌組織和幾乎100%的鼻咽癌細(xì)胞株有p53蛋白過表達(dá)(overexpression)或稱為聚集(accumulation)[3~5].近年來研究認(rèn)為,在鼻咽癌細(xì)胞中過表達(dá)的p53蛋白功能可能異?；蚴Щ?從而不能發(fā)揮阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)凋亡的生物學(xué)作用.由于鼻咽癌中p53突變率小,因此極有可能是細(xì)胞蛋白或病毒蛋白與其結(jié)合后使其在鼻咽癌中聚集與失活.有研究發(fā)現(xiàn),高表達(dá)的細(xì)胞瘤基因蛋白MDM2與p53結(jié)合抑制p53蛋白的轉(zhuǎn)錄活性,加速p53蛋白泛素化和降解,導(dǎo)致p53功能失活.胡巍等采用p53免疫共沉淀結(jié)合電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS/MS)分析從鼻咽癌細(xì)胞的總蛋白質(zhì)中鑒定了9個p53結(jié)合蛋白,包括GRP-78、GRP-75、GRP-94、核纖層蛋白A/C、DNA復(fù)制準(zhǔn)許因子/MCM3蛋白、蛋白激酶C(PKC)等,它們可能作為p53相互作用蛋白,與鼻咽癌中p53蛋白的聚集有著密切的聯(lián)系.熱休克蛋白如HSP-70和HSP-90家族成員可與p53蛋白結(jié)合導(dǎo)致p53蛋白核外排(nuclearexclusion),即p53蛋白被分隔(sequestration)于細(xì)胞漿,不能進(jìn)入細(xì)胞核而發(fā)揮作用.另外有研究報道,鼻咽癌的發(fā)生與EB病毒感染關(guān)系密切,EB病毒感染與p53蛋白過表達(dá)/集聚呈正相關(guān),EB病毒的一些基因產(chǎn)物BZLF1、EBNA-5、EBNA-1、EBNA-2、LMPS甚至EBERS可與野生型p53蛋白穩(wěn)定結(jié)合,p53蛋白半衰期延長,導(dǎo)致p53蛋白在鼻咽癌中過表達(dá)/聚集[10~13].可見鼻咽癌中p53蛋白聚集與失活的機制是十分復(fù)雜的,對此進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究已成為國內(nèi)外科研工作者重要的課題.蛋白質(zhì)組學(xué)以生命功能執(zhí)行者——蛋白質(zhì)為研究主體,動態(tài)、整體、定量地分析細(xì)胞蛋白質(zhì)種類、表達(dá)水平和修飾的變化,從生命本質(zhì)的層次上研究生命活動的規(guī)律以及重要的生理與病理現(xiàn)象.蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)及其研究方法與技術(shù)的不斷完善和發(fā)展,為從蛋白質(zhì)整體水平上篩選鼻咽癌中p53功能相關(guān)的蛋白質(zhì)分子,以進(jìn)一步研究p53在鼻咽癌中的作用機制提供了新的工具.另一方面,RNA干擾(RNAi)技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá),為此,本研究首先采用RNAi技術(shù)穩(wěn)定沉默鼻咽癌細(xì)胞系CNE2的p53基因的表達(dá),然后用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)高通量的分離、鑒定p53沉默鼻咽癌細(xì)胞株CNE2sip53與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空白載體的對照鼻咽癌細(xì)胞株細(xì)胞CNE2/pSUPER中差異表達(dá)的蛋白質(zhì),并對部分差異表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平進(jìn)行了驗證,以尋找與p53基因功能相關(guān)的蛋白質(zhì),為闡明鼻咽癌中p53蛋白聚集及失活的機制提供新線索.1材料和方法1.1材料表面1.1.1細(xì)胞低分化鱗狀上皮鼻咽癌細(xì)胞系CNE2由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所保存.用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液進(jìn)行傳代培養(yǎng).1.1.2內(nèi)部干擾系統(tǒng)1.1.3干膠條和覆蓋液丙烯酰胺、甲叉-雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉(SDS)、超純尿素、CHAPS、IPG緩沖液(pH4~7)、24cm固相化pH4~7梯度干膠條和覆蓋液購自AmershanPharmacia公司;二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺、TPCK處理的胰蛋白酶、鐵氰化鉀、三氟乙酸(TFA)、碳酸氫銨、硫代硫酸鈉、乙腈和CCA購自Sigma公司.鼠抗人β-Actin購自Sigma公司;鼠抗人p53、HSP27和GRP75單克隆抗體,羊抗人14-3-3σ,辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗,以及兔抗羊二抗購自美國SantaCruz公司;SYBRGreenⅠ混合染料購自TaKaRa公司.1.1.4ms公司的質(zhì)譜儀IPGphor等電聚焦儀、EttanDALT垂直電泳槽、Imagescanner掃描儀系A(chǔ)mershamBiosciences公司產(chǎn)品;AppliedBiosystemVoyagerDESTRBiospectrometryTMWorkstationSystem4307MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀系A(chǔ)BI公司產(chǎn)品;Q-TOFmicroTM電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜系英國Micromass公司產(chǎn)品;LightCyclerSystem熒光PCR儀系德國Roche公司產(chǎn)品.1.2方法1.2.1d雙酶切重組質(zhì)粒的鑒定將合成的寡核苷酸退火后與用BglⅡ和HindⅢ雙酶切的pSUPER載體連接.轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞及克隆擴增后,用EcoRⅠ和HindⅢ酶切鑒定重組質(zhì)粒,并進(jìn)一步測序鑒定.1.2.2轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的構(gòu)建在6孔板中,每孔接種2×105個CNE2細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中,細(xì)胞生長至80%匯合期,將重組pSUPER/sip53質(zhì)粒DNA或者pSUPER載體和脂質(zhì)體混合,加到細(xì)胞中培養(yǎng)12h后,用PBS溶液洗滌轉(zhuǎn)染中的細(xì)胞后,加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后,用含2mg/LPuromycin的選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng),14天后挑單個克隆擴大培養(yǎng),建成穩(wěn)定傳代的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系CNE2sip53-1,CNE2sip53-2和CNE2/pSUPER.1.2.3實時熒光pcr檢測收集對數(shù)生長期的CNE2sip53-1,CNE2sip53-2和CNE2/pSUPER細(xì)胞,按Trizol說明書提取總RNA,2μg總RNA用A3500逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)合成cDNA.熒光定量PCR引物應(yīng)用primer5.0進(jìn)行設(shè)計,p53s,5′CCTCCTCAGCATCTTAT-CCG3′;p53a,5′CAGCCTGGGCATCCTTG3′;GAPDHs,5′GTCAGTGGTGGACCTGACCT3′;GAPDHa,5′TGAGGAGGGGAGATTCAGTG3′.20μl實時定量(Real-timequantitative)RT-PCR反應(yīng)體系包括2μlcDNA,2μl的SYBRGreen1混合染料,0.5μl的10μmol/LPCR上游引物,0.5μl的10μmol/LPCR下游引物,1μl的25mmol/L氯化鎂和14μl去離子水.熒光PCR儀反應(yīng)條件為95℃變性10s;95℃4s,52℃(擴增p53)或者55℃(擴增GAPDH)20s,72℃15s,重復(fù)40~50個循環(huán);60℃至95℃繪制溶解曲線.實驗結(jié)果自動以CT值給出,相對表達(dá)量計算按照Livak等2-!!CT的方法進(jìn)行計算.實驗至少重復(fù)3次.1.2.4體外細(xì)胞總蛋白表達(dá)收集對數(shù)生長期的CNE2sip53-1,CNE2sip53-2和CNE2/pSUPER細(xì)胞,PBS充分清洗后加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解緩沖液(50mmol/LTrispH7.4,100mmol/LNaCl,1mmol/LMgCl2,2.5mmol/LNa3VO4,1mmol/LPMSF,2.5mmol/LEDTA,0.5%TritonX-100,0.5%NP-40,5mg/Lofaprotinin,pepstatinA和leupeptin1)冰上裂解40min.4℃12000g離心15min,取上清即為細(xì)胞總蛋白.Bradford方法測定蛋白質(zhì)濃度后,將上清500μg總蛋白進(jìn)行12.5%SDS分離,蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上,印跡膜5%脫脂牛奶室溫封閉2h,1∶1000稀釋的鼠抗人p53一抗4℃孵育過夜,PBS洗滌3次,每次10min.1∶2000稀釋的羊抗鼠二抗室溫溫育1h時,PBS洗滌3次,ECL試劑發(fā)光及顯影.以β-Actin為內(nèi)參照.實驗至少重復(fù)3次.1.2.5蛋白質(zhì)等電聚合酶dtis和雙標(biāo)樹葉片質(zhì)用細(xì)胞刮收集對數(shù)生長期CNE2sip53(即CNE2sip53-1)和CNE2/pSUPER細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液(7mol/L尿素,2mol/L硫脲,100mmol/LDTT,4%CHAPS,40mmol/LTris,2%Pharmalyte,1g/LDNaseⅠ)裂解2h,低溫離心機12000r/min離心45min后取上清用蛋白質(zhì)定量試劑盒2DQuantificationkit(AmershamBiosciences)測定蛋白質(zhì)濃度,其余分裝置-80℃凍存?zhèn)溆?細(xì)胞總蛋白1.2mg與水化液(8mol/L尿素,4%CHAPS,40mmol/LTris,18mmol/LDTT,0.5%IPG緩沖液pH4~7,痕量溴酚藍(lán))混合,上樣總體積450μl.30V水化14h后經(jīng)500V1h、1000V1h、8000V8.5h進(jìn)行等電聚焦.等電聚焦后分別于10ml平衡A液(6mmol/L尿素,2%SDS,30%甘油,50mmol/LTris-HClpH8.8,0.2%DTT,痕量溴酚藍(lán))和10ml平衡B液(6mmol/L尿素,2%SDS,30%甘油,50mmol/LTris-HClpH8.8,3%碘乙酰氨,痕量溴酚藍(lán))各平衡15min.平衡后的IPG膠條轉(zhuǎn)移至12%0.75mmSDS膠上端進(jìn)行第二向垂直電泳.考馬斯亮藍(lán)染色參照“Bluesilver”染色方法.1.2.6小鼠細(xì)胞中cne2sip33及cne2/p-p-pcd表達(dá)應(yīng)用Imagescanner掃描儀對考馬斯亮藍(lán)染色的2-DE膠掃描.對CNE2sip53及CNE2/pSUPER每株細(xì)胞的3張雙向電泳圖,使用PDQuest2-DE軟件進(jìn)行匹配成組,組間比較并選取2倍以上變化的蛋白質(zhì)點為干擾與對照組差異表達(dá)的蛋白質(zhì)分子.1.2.7指紋圖譜的構(gòu)建切割蛋白質(zhì)點于1.5mlEP管中,50%乙腈和50mmol碳酸氫銨脫色30min,乙腈脫水冷凍抽干.加入10μlTPCK處理的胰蛋白酶(0.1mg/L)冰上吸脹40min,37℃酶解12h,30μl萃取液(100%乙腈與5%三氟乙酸1∶1)萃取60min,重復(fù)2次.將萃取液收集于0.5mlEP管冷凍濃縮至約10μl,取0.5μl樣品與1μl基質(zhì)液CCA混合,點樣于不銹鋼板.MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀采用反射模式,正離子譜測定,離子源加速電壓20000V,反射電壓比1.12,N2激光波長337nm,脈沖寬度3ns,離子延遲提取100ns,真空度4×10-7Torr,質(zhì)譜信號單次掃描累加50次,質(zhì)譜使用胰蛋白酶自降解峰m/z842.50和m/z2211.10作為內(nèi)校正,獲得肽質(zhì)量指紋圖譜.Mascot軟件檢索SwissProt數(shù)據(jù)庫鑒定差異表達(dá)蛋白質(zhì).1.2.8蛋白質(zhì)點測定結(jié)果為保證蛋白質(zhì)點鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性,所有樣品均進(jìn)行ESI-Q-TOF分析,對部分肽片段測序,得到相應(yīng)的肽序列標(biāo)簽.所有測定均在正離子方式下進(jìn)行.霧化氣體為氮氣,碰撞氣體為氬氣.源溫80℃,錐孔電壓50V,TOF加速電壓為0.2kV,MCP檢測器電壓為2.7kV,LC-ESI-MS/MS自動分析時,毛細(xì)管電壓為3000V.測定結(jié)果儀器以peaklist文件形式給出,通過Mascot軟件檢索SwissProt數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)點,并得到部分肽片段測序.1.2.9不同程度的蛋白質(zhì)印花試驗存在差異方法同前所述,1∶1000稀釋的鼠抗人HSP27、GRP75或羊抗人14-3-3σ一抗室溫溫育1h.實驗至少重復(fù)3次.1.2.1pcna3.1-flag-p33質(zhì)粒dna的表達(dá)分析1-FLAG-p53轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞.在6孔板中,每孔接種2×105個CNE2細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中,細(xì)胞生長至80%匯合期,將pcDNA3.1-FLAG-p53質(zhì)粒DNA或者pcDNA3.1-FLAG載體和脂質(zhì)體混合,加到細(xì)胞中培養(yǎng)6h后,換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),轉(zhuǎn)染36h后收集細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析差異蛋白質(zhì)HSP27、14-3-3σ和GRP75的表達(dá)水平.2結(jié)果2.1穩(wěn)定干擾p33的肺癌細(xì)胞系的構(gòu)建采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將pSUPER/sip53的真核表達(dá)載體導(dǎo)入CNE2細(xì)胞中,經(jīng)Puromycin篩選,挑選抗性克隆擴大培養(yǎng),建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系.用Real-timequantitativeRT-PCR技術(shù)以及蛋白質(zhì)印跡分析進(jìn)行了驗證,挑選出穩(wěn)定干擾p53的鼻咽癌細(xì)胞系.實驗結(jié)果顯示2株干擾效果較好的細(xì)胞系:在干擾組CNE2sip53細(xì)胞中,p53mRNA的表達(dá)被顯著的抑制表達(dá)下調(diào),其中CNE2sip53-1細(xì)胞p53mRNA的表達(dá)下調(diào)達(dá)99.9%,CNE2sip53-2表達(dá)下調(diào)達(dá)97.5%(圖1),p53蛋白的表達(dá)幾乎被完全抑制(圖2).由此證實,經(jīng)過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染siRNA載體,得到了能持續(xù)表達(dá)p53siRNA的CNE2細(xì)胞系,本研究將CNE2sip53-1細(xì)胞株命名為CNE2sip53.2.2總蛋白質(zhì)點檢測建立了分辨率較高,重復(fù)性較好的細(xì)胞蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖譜,應(yīng)用PDQuest2DE軟件分析CNE2/pSUPER和CNE2sip53雙向電泳圖,分別可檢測到大約1100個蛋白質(zhì)點,經(jīng)成組比較共計有22個明顯差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點.與對照組CNE2/pSUPER細(xì)胞系相比,在CNE2sip53細(xì)胞系中有13個點如8,14,19,21等表達(dá)上調(diào),而9個點包括7,15,16等表達(dá)下調(diào).其典型的CNE2/pSUPER和CNE2sip53雙向電泳圖見圖3a.圖3b示局部放大的部分差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點.2.3氨基酸序列的表達(dá)22個差異蛋白質(zhì)點膠內(nèi)酶解,經(jīng)MALDI-TOF肽質(zhì)量指紋圖譜分析及ESI-Q-TOF肽序列標(biāo)簽驗證全部得以鑒定,其中8號cytokeratin18蛋白鑒定見圖4和圖5.8號蛋白的肽質(zhì)量指紋圖譜檢索SwissProt數(shù)據(jù)庫提示為cytokeratin18蛋白,經(jīng)ESI-Q-TOF驗證,來自8號蛋白的肽片段m/z2854.47被鑒定為SLGSVQAPSYGARPVSSAASVYAGAGGSGSR為cytokeratin18蛋白氨基酸序列的一部分.22個明顯差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點的詳細(xì)名稱見表2.這些蛋白質(zhì)根據(jù)數(shù)據(jù)庫查詢的功能大致可以分為5類:信號傳導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì),分子伴侶,與轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)蛋白質(zhì),代謝相關(guān)蛋白和細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)(表2).2.4蛋白質(zhì)印跡分析為了進(jìn)一步驗證比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究的結(jié)果,我們應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡檢測了部分蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的表達(dá)水平.圖6顯示蛋白質(zhì)印跡分析HSP27、14-3-3σ蛋白表達(dá)上調(diào),GRP75表達(dá)下調(diào)與蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果一致.2.5-flag-p33轉(zhuǎn)染cne2細(xì)胞后表達(dá)水平的變化為了進(jìn)一步驗證通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究得到的差異蛋白質(zhì)與p53的相關(guān)性,我們應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡檢測了部分蛋白質(zhì)在pcDNA3.1-FLAG-p53轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞后表達(dá)水平的改變.圖7顯示蛋白質(zhì)印跡分析與CNE2和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-FLAG載體相比,pcDNA3.1-FLAG-p53轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞引起p53表達(dá)顯著增加,同時HSP27、14-3-3σ蛋白表達(dá)下調(diào),GRP75表達(dá)上調(diào),與p53被穩(wěn)定干擾后蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化正好相反,進(jìn)一步說明它們確實是p53功能相關(guān)蛋白質(zhì).3k-ras算法與t-pcr擴增機制蛋白質(zhì)組是指“一個細(xì)胞或一個組織基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)”.蛋白質(zhì)組學(xué)是指應(yīng)用各種技術(shù)手段來研究蛋白質(zhì)組的一門學(xué)科,其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分,了解蛋白質(zhì)之間的相互作用和相互聯(lián)系,揭示蛋白質(zhì)功能和細(xì)胞生命活動規(guī)律.由于蛋白質(zhì)是細(xì)胞和組織的生命現(xiàn)象和生理活動的主要執(zhí)行者,應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)篩選p53功能相關(guān)的蛋白質(zhì)有著重要的價值,它是一種新的嘗試.本研究采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)建立了穩(wěn)定沉默p53基因的鼻咽癌細(xì)胞系CNE2sip53,用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分離、鑒定CNE2sip53細(xì)胞與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空白載體的對照鼻咽癌細(xì)胞株細(xì)胞CNE2/pSUPER中差異表達(dá)的蛋白質(zhì),成功地鑒定出22種p53功能相關(guān)的蛋白質(zhì),其中有14種蛋白質(zhì)包括HSP27,14-3-3σ,GRP78,HSP70等在CNE2sip53中表達(dá)上調(diào),8種蛋白質(zhì)包括hnRNPK,eIF4B,TPT1等在CNE2sip53中表達(dá)下調(diào).其中eIF4B,TPT1,hnRNPH3,SFRS1是首次報道可能與p53功能相關(guān)的蛋白質(zhì).為探討鼻咽癌中過表達(dá)的p53蛋白聚集及失活的機制提供了重要依據(jù)和線索.熱休克蛋白(heatshockproteins,HSPs)是生物體(或離體培養(yǎng)的細(xì)胞)在不良環(huán)境因素或者其他因素如感染、惡性腫瘤作用下誘導(dǎo)產(chǎn)生的具有高度保守性的應(yīng)激蛋白,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、腫瘤免疫以及機體對腫瘤治療藥物耐藥性的發(fā)生和腫瘤的預(yù)后等都有密切關(guān)系.Wu和Taira等的研究表明,p53可以通過與CCAAT結(jié)合因子(CBF)來抑制HSP70的基因轉(zhuǎn)錄.Wadhwa等實驗證明,mot-2/mthsp70/GRP75能結(jié)合在p53蛋白C端312~352氨基酸殘基部位,有多個結(jié)合位點,使野生型p53失去了對轉(zhuǎn)化細(xì)胞的抑制作用,導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化,從而使得轉(zhuǎn)化細(xì)胞永久性增殖.同時有研究發(fā)現(xiàn),HSPs通過影響細(xì)胞增殖過程必需的蛋白質(zhì)構(gòu)象而參與細(xì)胞周期.在神經(jīng)母細(xì)胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤等腫瘤中都發(fā)現(xiàn)HSPs能夠與p53聚合在一起形成復(fù)合體,延長p53蛋白的半衰期,從而增加了p53的穩(wěn)定性導(dǎo)致p53的積聚和功能失活.本研究發(fā)現(xiàn)HSP27,HSP70等HSPs在CNE2sip53中的高表達(dá),可能與失去p53的轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān),它們作為分子伴侶,可能在鼻咽癌細(xì)胞不斷增殖過程中協(xié)助蛋白質(zhì)的合成和穩(wěn)定,幫助其適應(yīng)或耐受不利的生長環(huán)境,有利于鼻咽癌細(xì)胞的生存和增殖.再者,本研究將野生型p53轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE2細(xì)胞后引起HSP27表達(dá)下調(diào)以及GRP75表達(dá)上調(diào),證明它們確實作為p53功能相關(guān)蛋白質(zhì),在鼻咽癌中可能通過與p53蛋白相互作用或者改變自身構(gòu)象來協(xié)調(diào)p53構(gòu)象的平衡,保護(hù)p53免受蛋白酶的降解,使p53在胞質(zhì)半衰期延長,同時通過參與p53的胞質(zhì)裝配、核轉(zhuǎn)運來調(diào)控p53功能,在鼻咽癌中p53蛋白聚集及失活發(fā)揮重要的作用.與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì)核內(nèi)不均一核糖核蛋白K(heterogeneousnuclearribonucleoproteinK,hnRNPK)在CNE2sip53中低表達(dá),14-3-3σ蛋白在CNE2sip53中高表達(dá).hnRNPK是一種進(jìn)化高度保守的核內(nèi)RNA結(jié)合蛋白,參與從染色體的再塑,轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),前體mRNA剪接到mRNA輸出等多種生物過程,從而進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控.研究發(fā)現(xiàn),hnRNPK作為DNA損傷引起的p53轉(zhuǎn)錄輔激活因子,通過增強c-myc,EGR和BRCA1基因的表達(dá),在DNA損傷引起的p53依賴的細(xì)胞周期俘獲中起著重要的作用.14-3-3σ蛋白可被γ射線和其他DNA損傷試劑強烈誘導(dǎo),是通過結(jié)合和分離磷酸化蛋白來調(diào)節(jié)細(xì)胞活性的蛋白質(zhì)家族中的一員.其誘導(dǎo)作用可通過位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游1.8kb的p53應(yīng)答元件介導(dǎo),當(dāng)14-3-3σ活化和表達(dá)增加后,使胞質(zhì)中CDK1/cyclinB1復(fù)合物(促使細(xì)胞周期從G2期向M期過渡)分離,從而阻斷CDC2和CDK1的相互作用并阻止細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂,使p53通過14-3-3σ完成對G2/M期調(diào)控.本研究中與轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)蛋白質(zhì)真核啟始因子4B(eukaryoticinitiationfactor4B,eIF4B)在CNE2sip53中低表達(dá).eIF4B能促進(jìn)eIF4A和eIF4F翻譯激活中RNA依賴的ATP水解活性和ATP依賴的RNA解旋活性.研究報道,p53的激活引起caspase非依賴蛋白的表達(dá)下調(diào),同時可引起作為凋亡細(xì)胞水解底物和在蛋白質(zhì)合成中其重要作用的eIF4GI和eIF4B裂解.但文獻(xiàn)中尚未見報道14-3-3σ、hnRNPK和eIF4B在鼻咽癌中與p53功能相關(guān),它們在鼻咽癌中可能作為新的p53功能相關(guān)的蛋白質(zhì),為鼻咽癌p53蛋白聚集及失活的機制提供了重要線索,其機理和意義有必要進(jìn)一步研究.此外,本研究識別的p53功能相關(guān)蛋白質(zhì)還有與代謝相關(guān)蛋白,如細(xì)胞色素b5(Cytochromeb5,CYTb5),無機焦磷酸酶(inorganicpyrophosphatase)和過渡型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ATP酶(transitionalendoplasmicreticulumATPase)等,細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì),如細(xì)胞角蛋白8(cytokeratin8),細(xì)胞角蛋