不同相對(duì)分子量的殼聚糖抑菌作用及機(jī)理研究

不同相對(duì)分子量的殼聚糖抑菌作用及機(jī)理研究

1979年，allan等人提出了殼聚糖的抗菌性，其抗菌性和抗菌機(jī)制一直是國(guó)內(nèi)外科學(xué)家的研究熱點(diǎn)，相關(guān)報(bào)告層出不窮。但對(duì)其抑菌機(jī)理尚無(wú)明確定論,而且對(duì)不同相對(duì)分子質(zhì)量殼聚糖的抑菌效果的研究也不完全一致。目前關(guān)于殼聚糖抑菌作用規(guī)律的研究較少,作為系統(tǒng)研究之一,本文采用體外抑菌法分別測(cè)定了六種不同相對(duì)分子量的殼聚糖對(duì)五種常見菌的抑菌活性,對(duì)殼聚糖的抑菌機(jī)理做了探討,以期為殼聚糖開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。1實(shí)驗(yàn)設(shè)備和材料1.1上海合作大學(xué)s2cjbu好氧生化技術(shù)中心LDZX40CI型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋(上海中安醫(yī)療器械廠);生化培養(yǎng)箱(國(guó)華電器);SNCJ1BU無(wú)菌操作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司);DENSIMAT型細(xì)菌電比濁儀(法國(guó)生物梅里埃公司)。1.2實(shí)驗(yàn)材料1.2.1降解制備d相對(duì)分子量100萬(wàn)、80萬(wàn)(浙江玉環(huán)縣殼聚糖有限公司,DD.98%);20萬(wàn)、14萬(wàn)、10萬(wàn)、5萬(wàn)(DD.95%,H2O2-HAc降解制備);脫乙酰度(DD.)87%、98%由分子量為50萬(wàn)(DD.65%)的殼聚糖按文獻(xiàn)方法制得,DD.值測(cè)定采用酸堿滴定法。1.2.2供試菌種大腸桿菌(Escherichiacoli,ATCC35218),金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,ATCC26113),變形桿菌(Proteusspecies,ATCC12453),白色念珠菌(Candidaalbicans,ATCC10231),綠膿桿菌(P.aeruginosa,ATCC27853)由天水市中醫(yī)醫(yī)院化驗(yàn)科提供。1.2.3牛肉浸膏ph的確定pH7.1;肉湯培養(yǎng)基(0.3gNaCl,1.0g蛋白胨,0.3g牛肉浸膏每100mL溶液),1mol/LNaOH調(diào)其pH=6.3。2實(shí)驗(yàn)方法2.1皮聚糖室外感染實(shí)驗(yàn)2.1.1細(xì)菌的激活受試菌種(標(biāo)準(zhǔn)菌株)接種于固體瓊脂培養(yǎng)基,37℃活化24h,金黃色葡萄球菌活化48h。2.1.2懸浮液的制備將活化后的受試菌種用接種環(huán)挑取菌苔于生理鹽水中,制成含菌數(shù)濁度約為0.5Mcf的菌懸液備用。2.1.3殼聚糖濃度對(duì)培養(yǎng)基的影響將直徑為6mm的圓形濾紙片放入各不同分子量、不同濃度的殼聚糖溶液中一同高壓蒸汽滅菌(120℃、0.12MPa)20min。取各菌懸液100μL均勻涂抹在培養(yǎng)基平皿表面,用無(wú)菌鑷子將各濾紙片貼在各種含菌平皿上,每皿貼7個(gè),分別對(duì)應(yīng)于6種殼聚糖濃度及對(duì)照。實(shí)驗(yàn)殼聚糖濃度設(shè)置分別為2%、1.5%、1.0%、0.5%、0.25%、0.125%。培養(yǎng)皿中間貼1%的醋酸為對(duì)照,對(duì)照樣除不加殼聚糖外,其他條件與加有殼聚糖的培養(yǎng)基一致。每種菌種重復(fù)3次試驗(yàn),在37℃下培養(yǎng)24h,測(cè)定圓濾紙片的抑菌圈直徑。2.2殼聚糖的最低抑制濃度測(cè)定取15mL融化的瓊脂培養(yǎng)基,加入等量不同分子量的殼聚糖-1%HAc溶液,使每個(gè)試管殼聚糖含量分別為0.025%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%,滅菌,冷卻后加入100μL約0.5Mcf的各被試菌菌懸液,涂布均勻后于37℃培養(yǎng)24h,觀察菌落生長(zhǎng)情況,以不長(zhǎng)菌的殼聚糖最低濃度為殼聚糖對(duì)各供試菌的最低抑制濃度。2.3殼聚糖的測(cè)定接種前先用顯微鏡活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定每毫升菌液中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的含菌個(gè)數(shù),實(shí)驗(yàn)中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別為1.0×106個(gè)/mL、2.5×106個(gè)/mL。用移液槍各移取500μL至不同脫乙酰度的殼聚糖溶液及肉湯培養(yǎng)基中,使溶液中殼聚糖含量為1.0%。每24h取樣,在血球板計(jì)數(shù)器上觀察讀數(shù),直到所有樣品和對(duì)照中的菌體數(shù)量基本不變化為止。繪制細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線和不同脫乙酰度殼聚糖對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌曲線。3結(jié)果與討論3.1殼聚糖的抑菌活性分析表1～5數(shù)據(jù)可以看出,殼聚糖分子量對(duì)其抑菌活性有很大的影響。對(duì)于各被試菌,殼聚糖分子量與其抑菌性能大小大致成曲線關(guān)系。其總體趨勢(shì)表現(xiàn)為低分子量的殼聚糖抑菌活性強(qiáng)于高分子量殼聚糖,尤其是對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌和綠膿桿菌最為明顯。對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌,大分子量殼聚糖也表現(xiàn)出較好的抑菌活性,這是因?yàn)闅ぞ厶窃谌芤褐谐薀o(wú)規(guī)則線團(tuán)狀,隨著分子量的增加,其分子鏈的柔韌性和卷曲程度增加,同時(shí)端基減少,使得殼聚糖內(nèi)消毒因子-NH2含量也略有增多,二者均使其對(duì)細(xì)菌的吸附和絮凝能力增強(qiáng);但分子量太大時(shí),溶液的粘度增加,殼聚糖分子鏈的卷曲和纏結(jié)程度增加,使部分消毒因子-NH2被包埋在大分子的無(wú)規(guī)則團(tuán)中,影響了其對(duì)細(xì)菌的吸附及與細(xì)菌的反應(yīng)能力,此時(shí)分子量較小的殼聚糖則發(fā)揮靈活運(yùn)動(dòng)的優(yōu)勢(shì),減少了分子間氫鍵的形成,表現(xiàn)了較好的抑菌活性。另外,可能還與對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌不同的抑菌機(jī)理有關(guān)。3.2分子量殼聚糖抑菌圈直徑的確定從不同濃度的殼聚糖對(duì)各被試菌的抑菌圈直徑大小可以看出,無(wú)論是低分子量殼聚糖還是高分子量殼聚糖,隨著濃度的不斷增加,其抑菌圈直徑逐漸增大。原因歸結(jié)為殼聚糖中-NH2的存在,隨著殼聚糖濃度的不斷增加,溶液中-NH2的濃度也將增加,從而抑菌效果也增強(qiáng)。3.3脫乙酰度對(duì)殼聚糖抑菌性能的影響由圖1、2可看出,含殼聚糖樣品組的菌體的生長(zhǎng)要比不含殼聚對(duì)照組慢,對(duì)照組在24～48h便可到達(dá)生長(zhǎng)頂點(diǎn)(大腸桿菌菌體數(shù)量超過(guò)5.85×108個(gè)/mL、金黃色葡萄球菌4.8×108個(gè)/mL),而樣品組要在48～96h間才達(dá)到生長(zhǎng)頂點(diǎn),且隨著殼聚糖脫乙酰度(DD.)的增高,其對(duì)菌體生長(zhǎng)的延緩作用時(shí)間也更長(zhǎng)。隨著脫乙酰度的逐漸增大,殼聚糖的抑菌能力增強(qiáng),說(shuō)明脫乙酰度對(duì)殼聚糖的抑菌性能有影響。這是因?yàn)闅ぞ厶堑拿撘阴；?實(shí)際上是其分子鏈上親脂性基團(tuán)–NHCOCH3逐漸被親水基團(tuán)-NH2取代的過(guò)程。在酸性條件下,-NH2易與H+結(jié)合形成NH+3,隨著脫乙酰度的逐漸增大,NH+3增多,對(duì)于細(xì)菌(帶負(fù)電荷)的靜電引力增強(qiáng),更多的細(xì)菌被絮凝、聚沉,其生長(zhǎng)繁殖也隨之減慢。這也說(shuō)明殼聚糖的抗菌活性與其-NH2有關(guān),-NH2是殼聚糖的消毒因子,與我們以前的研究結(jié)論相吻合。3.4革蘭氏菌抑制能力從表6可看出,殼聚糖對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的作用最為明顯,對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌)的抑制能力強(qiáng)與革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、綠膿桿菌);低分子量殼聚糖對(duì)各被試菌的最低抑菌濃度較高分子量殼聚糖的低。3.5殼聚糖的抗菌作用目前,關(guān)于殼聚糖的抑菌機(jī)理尚無(wú)定論。本試驗(yàn)結(jié)果表明,分子量是影響殼聚糖的抑菌、抗菌性能大小的最重要因素。無(wú)論是革蘭氏陽(yáng)性菌還是革蘭氏陰性菌,低分子量的殼聚糖的抑菌作用均優(yōu)于高分子量的殼聚糖。低分子量殼聚糖有一定殺菌作用,是因?yàn)榉肿恿吭叫?越容易進(jìn)入細(xì)胞壁的空隙結(jié)構(gòu)內(nèi),干擾細(xì)胞的新陳代謝而達(dá)到殺菌目的。高分子量殼聚糖具有較強(qiáng)的抑菌、殺菌作用,其抗菌性能源于抗菌因子-NH+3,且高分子量殼聚糖具有很好的成膜特性,能在細(xì)胞表面形成足夠致密的膜以阻止細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)輸入。之所以低分子量殼聚糖有較好的抗菌活性,是因?yàn)槠浼醇鎮(zhèn)涑赡ぬ匦?又較高分子量殼聚糖易與進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞中。另外,從我們長(zhǎng)期的研究發(fā)現(xiàn),殼聚糖的抑菌、抗菌作用還與被試菌種及其介質(zhì)環(huán)境等有關(guān)?？偟膩?lái)說(shuō),殼聚糖對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制作用比革蘭氏氏陰性菌強(qiáng)。這可以從其細(xì)胞壁的組成來(lái)分析,革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁較厚(15～80nm),結(jié)構(gòu)緊密,且細(xì)胞壁含有豐富的磷壁酸使細(xì)胞壁形成一個(gè)負(fù)電荷環(huán)境,革蘭氏陰性菌細(xì)胞的壁薄(9～11nm),交聯(lián)松散。所以,高分子量殼聚糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用可能主要以成膜阻斷營(yíng)養(yǎng)源為主,低分子量殼聚糖對(duì)大腸桿菌的抑菌作用主要以進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞干擾其代謝為主。我們對(duì)水溶性殼聚糖、殼寡糖的抑菌性能已經(jīng)作了較為系統(tǒng)的研究,認(rèn)為殼聚糖只有在酸性介質(zhì)中(pH<6.3)才能表現(xiàn)出較好的抑菌活性,其抑菌活性大小順序依次為殼聚糖、殼寡糖、水溶性殼聚糖,這可能與它們不同的作