高溫煅燒貝殼粉抑菌性研究

高溫煅燒貝殼粉抑菌性研究

外殼是軟體動(dòng)物的外套筒，具有特殊的腺體細(xì)胞。這些分泌物可以形成保護(hù)身體柔軟部分的鈣化物，稱為外殼。我國(guó)海域遼闊,是海洋貝類的生產(chǎn)大國(guó),近年來,貝類的養(yǎng)殖和加工成為沿海和海島經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要組成部分,我國(guó)貝類的產(chǎn)量和加工量每年已達(dá)到數(shù)百萬噸甚至上千萬噸之多。貝殼資源極其豐富且品種繁多,但同時(shí)產(chǎn)生大量的廢棄物,每年都有數(shù)百萬噸的空貝殼被丟棄在海岸邊。大量的貝殼嚴(yán)重污染了環(huán)境,破壞了海岸邊應(yīng)有的景色,貝殼污染已成為沿海地區(qū)亟待解決的環(huán)境問題之一,如何回收利用這些貝殼資源成為我們關(guān)注的的問題。從海洋貝殼中提取的天然保鮮劑也具有較好的抗菌保鮮作用。在目前的研究中,將貝殼粉采用高溫灼燒后制取活性氧化鈣,并以常見食品為保鮮材料,就活性氧化鈣的制作及其抑菌作用做了初步探討。還有比較了不同貝殼煅燒物對(duì)豬瘦肉和豆腐干的防腐效果。截至發(fā)稿前尚未見系統(tǒng)地研究貝殼粉煅燒物的抑菌效果并對(duì)其抑菌條件進(jìn)行優(yōu)化的報(bào)道。本研究先驗(yàn)證了貝殼粉的抑菌效果,進(jìn)而改進(jìn)了抑菌試驗(yàn)方法,同時(shí)優(yōu)化了試驗(yàn)條件,確定了高溫煅燒貝殼粉適宜的抑菌條件。為回收利用貝殼資源、開發(fā)新型天然生物保鮮劑提供了理論依據(jù)。1材料、機(jī)器和方法1.1菌種和試劑材料:海灣扇貝,豐瑞水產(chǎn)食品有限公司提供;金黃色葡萄球菌、大腸桿菌,本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。試劑:營(yíng)養(yǎng)瓊脂,北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠;氧化鈣,國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?水為無菌水。1.2儀器、試劑與儀器高溫馬福爐(SX2-2.5-12型):上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;四兩裝高速中藥粉碎機(jī)(QE-200g型):武義縣屹立工具有限公司;超聲波破碎儀(JY-150B型):北京天恩翰拓科技有限公司;漩渦混合器(QL-861型):海門市麒麟醫(yī)用儀器廠;電熱鼓風(fēng)干燥箱(101-0型):天津市泰斯特儀器有限公司;超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1F型):蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司,不銹鋼手提式滅菌器(DSX-280A型):上海申安醫(yī)療器械廠;電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH3600Ⅱ型):天津市泰斯特儀器有限公司;牛津杯(6mm×7.8mm×10mm):石家莊偉天科學(xué)儀器設(shè)備有限公司。1.3測(cè)試方法1.3.1殼粉失重率的測(cè)定材料預(yù)處理:將海灣扇貝于適量水中煮至扇貝自然開口,取出扇貝閉殼肌、內(nèi)臟等內(nèi)容物,將貝殼沖洗干凈,于自然條件下晾干,稱取適量于四兩裝高速中藥粉碎機(jī)中粉碎5min,粉碎3次,過80目篩,備用。高溫煅燒:稱取適量粉碎好的貝殼粉于10個(gè)坩堝中,每2個(gè)坩堝設(shè)為一組,每組溫度分別為900℃,950℃,1000℃,1050℃,1100℃,煅燒溫度為2h。然后將貝殼粉在電熱干燥箱中干燥至恒重,放置于干燥器中。通過稱量貝殼粉煅燒前后質(zhì)量,計(jì)算貝殼粉失重率,計(jì)算得失重率為44.25%。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)知,貝殼粉煅燒完全。1.3.2超聲波破碎液的制備取無菌小試管,分別將在5個(gè)不同溫度下煅燒的貝殼粉用無菌水配制成濃度為0.0312%、0.0625%、0.125%、0.25%、0.5%,1%的懸濁液10mL。并將配制好的貝殼粉抑菌劑在超聲波破碎儀中處理一定時(shí)間和不做超聲處理作為對(duì)照。同時(shí)配制同樣濃度的CaO作為對(duì)照。1.3.3細(xì)菌總數(shù)測(cè)定將實(shí)驗(yàn)室保藏菌種金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進(jìn)行活化,配制成菌懸液,并控制細(xì)菌總數(shù)在105cfu/mL~106cfu/mL,作為試驗(yàn)受試菌。參照GB/T47892-2003菌落總數(shù)測(cè)定方法。1.3.4抗菌性能試驗(yàn)通過抑菌圈試驗(yàn)、最小抑菌濃度測(cè)定試驗(yàn)及抑菌率測(cè)定試驗(yàn)評(píng)價(jià)高溫煅燒貝殼粉的抑菌作用。1.3.4.抑菌圈直徑測(cè)定受試菌自由基活性本試驗(yàn)采用瓊脂擴(kuò)散法的牛津杯法評(píng)價(jià)貝殼粉抑菌劑的抑菌活力。通過抑菌圈直徑的大小確定抗菌劑抗菌能力的強(qiáng)弱。用吸管準(zhǔn)確量取預(yù)先配制好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基20mL,加入內(nèi)徑一致并預(yù)先水平放置的培養(yǎng)皿內(nèi),凝固后并使培養(yǎng)皿中水分干燥透。取200μL的受試菌懸液在平板上并用無菌玻耙涂布均勻,涂布后以平板無可見水滴為準(zhǔn),此時(shí)的平板立刻進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。用無菌鑷子將滅菌的牛津杯輕輕放入培養(yǎng)皿中,在水平放置的培養(yǎng)皿中均勻地放置4只牛津杯。用移液槍精準(zhǔn)吸取一定濃度的貝殼粉抑菌劑200μL至牛津杯中,注意不要將菌懸液溢出牛津杯外。同時(shí)吸取無菌水和同樣濃度的CaO溶液至牛津杯中作為對(duì)照。將加入抑菌劑的培養(yǎng)皿在3℃~4℃冰箱中靜置一定時(shí)間(即做擴(kuò)散處理)和不做擴(kuò)散處理作為對(duì)照,然后在受試菌最適生長(zhǎng)溫度37℃下,培養(yǎng)24h,拍照并測(cè)量抑菌圈直徑。平行試驗(yàn)3次,求其平均值,試驗(yàn)重復(fù)2次。1.3.4.mic的測(cè)序根據(jù)最小抑菌濃度測(cè)定試驗(yàn)原理,將不同濃度的抗菌劑分別溶解于含100mL已滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的錐形瓶中,移取一定量的已知濃度的菌懸液分別接種于含抗菌劑的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的錐形瓶中,作為試驗(yàn)組;以同樣方法移取一定量的已知濃度的菌懸液接種于不含抗菌劑的錐形瓶中,作為陽性對(duì)照組;取只含有100mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的錐形瓶,不接種試驗(yàn)菌,作為陰性對(duì)照組。試驗(yàn)前已計(jì)算出試驗(yàn)菌懸液的濃度,應(yīng)使試驗(yàn)組和陽性對(duì)照組的錐形瓶中接種的試驗(yàn)菌濃度為5×105~5×106cfu/mL,并對(duì)陽性對(duì)照組進(jìn)行0h活菌計(jì)數(shù)(0小時(shí)活菌計(jì)數(shù)用來確定試驗(yàn)菌的準(zhǔn)確濃度及作為判定MIC的參考)。最后將試驗(yàn)組、陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組及0h活菌計(jì)數(shù)的培養(yǎng)皿同時(shí)放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24h,觀察結(jié)果。當(dāng)陽性對(duì)照組有細(xì)菌生長(zhǎng)(混濁),陰性對(duì)照組無菌生長(zhǎng)(透明),試驗(yàn)組無菌生長(zhǎng)的最高稀釋度所對(duì)應(yīng)的抗菌劑濃度,即為該抗菌劑對(duì)受試菌的MIC。1.3.4.殘留細(xì)菌數(shù)的測(cè)定將盛有10mL煅燒物懸液的三角瓶放于磁力攪拌器上,開動(dòng)磁力攪拌器,使三角瓶中的懸浮液保持均勻穩(wěn)定。再將100μL菌懸液注入上述三角瓶中,從三角瓶中取出100μL液體,立即注入9.9mL生理鹽水中稀釋,振蕩均勻。從上述生理鹽水中取出1mL,采用平板稀釋法測(cè)定殘留的細(xì)菌數(shù),于37℃培養(yǎng)24h計(jì)算菌落數(shù)。同時(shí)做一對(duì)照試驗(yàn)(即用未經(jīng)任何處理的受試菌鋪平板,計(jì)算菌落數(shù)),以計(jì)算抑菌率。2結(jié)果與討論2.1抑菌圈及抑菌效果由培養(yǎng)基擴(kuò)散法初步確定抑菌劑對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抗菌能力大小,結(jié)果以抑菌圈直徑大小(單位mm)表示,見表1、圖1、圖2。根據(jù)文獻(xiàn)中對(duì)抑菌作用的判斷:抑菌圈直徑小于或等于7mm者,判為無抑菌作用;抑菌圈直徑大于7mm者,有弱抑菌作用;抑菌圈在10~20mm者,有中等抑菌作用;抑菌圈直徑大于20mm者,有強(qiáng)抑菌作用。由表1可知,貝殼粉抑菌劑有抑菌作用,且不同煅燒溫度及不同濃度的抑菌劑抑菌效果不同。由營(yíng)養(yǎng)肉湯稀釋法測(cè)試抗菌劑抑菌性能,可測(cè)定配合物的最小抑菌濃度(MIC),數(shù)據(jù)見表2。根據(jù)文獻(xiàn)最小抑菌濃度低于800μg/mL即認(rèn)為有抗菌作用,最小抑菌濃度越小則表明抗菌劑的抗菌性能越好。抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明,該抗菌劑對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌有良好的抑制作用,且對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果優(yōu)于對(duì)大腸桿菌的抑菌效果。通過以上試驗(yàn)結(jié)果,可證明所制備的物質(zhì)可以作為抑菌劑使用。為了進(jìn)一步提高抑菌效果,將貝殼粉懸液進(jìn)行超聲波破碎及對(duì)加入抑菌劑的平皿做擴(kuò)散處理,并與常規(guī)抑菌方法進(jìn)行比較。以煅燒溫度、煅燒時(shí)間、貝殼粉濃度、超聲時(shí)間以及擴(kuò)散時(shí)間為單因素,進(jìn)行正交試驗(yàn),確定最佳試驗(yàn)條件。2.2單因素試驗(yàn)2.2.1超聲波破碎法取煅燒溫度分別為900℃,950℃,1000℃,1050℃,1100℃的貝殼粉,配制濃度為0.5%的抑菌劑在超聲波破碎儀中破碎20min,接下來處理見1.3.4.1,擴(kuò)散處理的時(shí)間為24h,得到結(jié)果(如圖3所示)。可以看出,隨著煅燒溫度的增加,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑都增加,當(dāng)溫度達(dá)到1050℃以上時(shí),抑菌圈直徑增加緩慢。因此為了節(jié)約能源,確定煅燒溫度1050℃為最佳試驗(yàn)條件。2.2.2超聲波破碎法取煅燒溫度分別為1000℃,配制濃度為0.0625%,0.125%,0.25%,0.5%,1%的抑菌劑在超聲波破碎儀中破碎20min,接下來處理見1.3.4.1,擴(kuò)散處理的時(shí)間為24h,得到結(jié)果(如圖4所示)。可以看出,隨著濃度的增加,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑都增加,但從食品防腐劑添加范圍和節(jié)省成本角度考慮,確定抑菌劑濃度1%為最佳試驗(yàn)條件。2.2.3超聲破碎時(shí)間取煅燒溫度分別為1000℃,配制濃度為0.5%的抑菌劑在超聲波破碎儀中分別破碎10,15,20,25,30min,接下來處理見1.3.4.1,擴(kuò)散處理的時(shí)間為24h,得到結(jié)果(如圖5所示)。可以看出,隨著超聲破碎時(shí)間的增加,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑都增加,當(dāng)時(shí)間達(dá)到20min以上時(shí),抑菌圈直徑都開始減小。因此確定破碎時(shí)間15min為最佳試驗(yàn)條件。2.2.4擴(kuò)散處理后的化學(xué)成分?jǐn)U散化取煅燒溫度分別為1000℃,配制濃度為0.5%的抑菌劑在超聲波破碎儀中分別破碎20min,接下來處理見1.3.4.1,擴(kuò)散處理的時(shí)間分別為8h,16h,24h,32h,40h,得到結(jié)果(如圖6示)。可以看出,隨著擴(kuò)散時(shí)間的增加,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑都增加,當(dāng)時(shí)間達(dá)到24h以上時(shí),抑菌圈直徑增加緩慢。因此確定擴(kuò)散時(shí)間24h為最佳試驗(yàn)條件。2.3正交試驗(yàn)結(jié)果為確定在多因素條件下的最佳煅燒溫度、貝殼粉濃度、超微粉碎時(shí)間、擴(kuò)散時(shí)間,進(jìn)行正交試驗(yàn)選用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)方案設(shè)計(jì),因素水平見表3,試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。2.4對(duì)菌種抑菌圈直徑對(duì)比由表4中的極差分析可知:4種因素對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果的影響大小均為:C>A>B>D,根據(jù)正交試驗(yàn)抑菌圈直徑的大小,可以得出最優(yōu)的抑菌條件為A3B1C3D2(大腸桿菌,如圖7所示)和A3B2C3D2(金黃色葡萄球菌)。但從正交試驗(yàn)結(jié)果表中可以看出兩種菌的抑菌方案均為A3B1C3D2抑菌圈直徑最大,這與對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌結(jié)果不一致,因此對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。同時(shí)進(jìn)行2次平行試驗(yàn),測(cè)得金黃色葡萄球菌A3B1C3D2方案抑菌圈直徑為21.82mm,A3B2C3D2方案抑菌圈直徑為22.64mm,證實(shí)A3B2C3D2最佳組合(如圖8所示)。而在此條件下未經(jīng)超聲波粉碎處理和擴(kuò)散處理的常規(guī)抑菌試驗(yàn)的對(duì)照中,得到的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌圈平均直徑分別為16.86mm和20.82mm。3抑菌機(jī)理分析1)通過抑菌圈試驗(yàn)、最小抑菌濃度測(cè)定試驗(yàn)及抑菌率測(cè)定試驗(yàn)表明貝殼粉有一定的抑菌作用可作為抑菌劑使用。為進(jìn)一步提高抑菌作用,以貝殼粉煅燒時(shí)間、貝殼粉濃度、超聲時(shí)間以及擴(kuò)散時(shí)間為因素,對(duì)抑菌效果進(jìn)行研究,得出最優(yōu)試驗(yàn)條件為煅燒溫度1100℃、貝殼粉濃度1%,超聲粉碎時(shí)間15min以及擴(kuò)散時(shí)間16h(大腸桿菌)和24h(金黃色葡萄球菌),大腸桿菌抑菌圈直徑17.86mm金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為22.64mm。而在此條件下未經(jīng)超聲波粉碎處理和擴(kuò)散處理的常規(guī)抑菌試驗(yàn)的對(duì)照中,得到的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌圈平均直徑分別為16.86mm和20.82mm。這主要由三方面作用引起:一是高溫煅燒使貝殼粉在分子結(jié)構(gòu)上發(fā)生了特殊的變化,使其具有了更好的穩(wěn)定性和抑菌效果;二是超聲波粉碎使貝殼粉粒徑變小,使顆粒分散更均勻,更好的溶于抑菌劑溶劑中,單位體積的貝殼粉數(shù)量增加,使抑菌效果增加;三是擴(kuò)散處理在3℃~4℃條件下作用一定時(shí)間,使受試菌處于緩慢生長(zhǎng)狀態(tài)時(shí),而抑菌劑更能充分?jǐn)U散,然后置于受試菌最適增長(zhǎng)溫度下培養(yǎng),使抑菌作用增強(qiáng)。2)通過試驗(yàn)可看出貝殼粉煅燒物的抑菌作用優(yōu)于CaO的抑菌作用,分析其抑菌機(jī)理:一是貝殼粉煅燒物引起細(xì)菌細(xì)胞膜電荷的變化,影響細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收或是滲透進(jìn)入到微生物細(xì)胞內(nèi),吸附細(xì)胞內(nèi)帶負(fù)電的細(xì)胞質(zhì),并發(fā)生絮凝作用,擾亂細(xì)胞正常的生理活動(dòng),從而殺滅細(xì)菌;二是貝殼