草魚-淀粉酶基因外顯子和5側(cè)翼序序列的克隆與克隆

草魚-淀粉酶基因外顯子和5'側(cè)翼序序列的克隆與克隆

根據(jù)其饑餓量，河流魚類可分為肉食、植物食、過濾食和各種食。它是河流水生生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。魚類食性因種類不同而異,食性與魚類本身的消化酶組成狀況密切相關(guān)。關(guān)于魚類消化酶的研究已有不少報(bào)道。淀粉酶作為重要的消化酶,對(duì)魚類食物的消化能力有重要的影響。所有魚類體內(nèi)都有淀粉酶存在,不同魚類淀粉酶的分泌器官存在差異,有的魚類主要由肝胰臟分泌,有的魚類腸道是分泌的重要器官。草魚(Ctenopharyngodonidellus),隸屬鯉形目,雅羅魚亞科,屬于草食性魚類,主要分布于長(zhǎng)江、珠江、黑龍江等江河及附屬水體,是淡水捕撈的主要對(duì)象。關(guān)于草魚淀粉酶的研究,倪壽文等研究了草魚肝胰臟淀粉酶的活性,并和其他幾種魚類做了比較。李廣麗和王義強(qiáng)研究了不同水溫、年齡及餌料組成情況下草魚淀粉酶活性的變化。α-淀粉酶水解葡萄糖高分子聚合物中的α-1ue00f4-糖苷鍵,作用于淀粉時(shí)生成糊精和還原糖,對(duì)動(dòng)植物及微生物體內(nèi)的淀粉降解起重要作用。α-淀粉酶基因廣泛存在于真核生物和原核生物基因組中。哺乳動(dòng)物有2類α-淀粉酶基因,唾液淀粉酶AMY1基因和胰淀粉酶AMY2基因;魚類只有胰淀粉酶基因,與人類的AMY2基因相似。動(dòng)物中多個(gè)物種的α-淀粉酶基因cDNA序列已確定。已知的魚類α-淀粉酶基因cDNA序列有鱖(Sinipercachuatsi)、尖吻鱸(Latescalcarifer)、斑馬魚(Brachydaniorerio)、大西洋鮭(Salmosalar)、青斑河豚(Tetraodonnigroviridis)、日本鰻鱺(Anguillajaponica)、胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)、美洲鰈(Pleuronectesamericanus)和斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)等。不同魚類α-淀粉酶基因cDNA序列具有高度的相似性?；蚩煞譃榻Y(jié)構(gòu)基因和非結(jié)構(gòu)基因。結(jié)構(gòu)基因是基因中編碼RNA或蛋白質(zhì)的堿基序列;非結(jié)構(gòu)基因是結(jié)構(gòu)基因兩側(cè)的一段不編碼的DNA片段,即側(cè)翼序列。在基因的表達(dá)中,側(cè)翼序列雖然不編碼氨基酸,卻在調(diào)節(jié)基因表達(dá)的過程中起著重要的作用。由于基因轉(zhuǎn)錄與否直接決定一個(gè)基因能否表達(dá),所以基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控的中心。轉(zhuǎn)錄起始水平的調(diào)控是最主要的環(huán)節(jié),側(cè)翼序列在這個(gè)過程中發(fā)揮這重要的作用。轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要受基因啟動(dòng)子以及起作用的順式作用元件控制,它們?cè)谵D(zhuǎn)錄水平精確地調(diào)控基因的表達(dá)。魚類α-淀粉酶基因5'側(cè)翼序列的研究?jī)H見鱖和尖吻鱸有報(bào)道。該研究克隆獲得草魚α-淀粉酶基因5'側(cè)翼序列,為進(jìn)一步研究不同食性魚類α-淀粉酶基因側(cè)翼序列的差異、魚類α-淀粉酶基因的表達(dá)、功能及調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1na小量試劑試驗(yàn)用的草魚為珠江流域魚類資源調(diào)查的樣本。AxyPrep基因組DNA小量試劑盒。GenomeWalkingKit,PMD19-T載體,大腸桿菌(E.coli)JM109感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于TAKARA公司。普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)于TIANGEN公司。1.2提取的胎盤dna從新鮮草魚剪取鰭條組織,基因組DNA的提取采用“AxyPrep基因組DNA小量試劑盒”,按照試劑盒說明書推薦方法操作。1.3pcr擴(kuò)增及聚合酶系統(tǒng)優(yōu)化根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫里已知脊椎動(dòng)物α-淀粉酶基因cDNA序列,利用PrimerPremier5.0在外顯子Ⅰ保守區(qū)域設(shè)計(jì)1對(duì)引物F和R(表1)。以上述提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為10×buffer(含Mg2+)2μL,10mmol·L-1dNTP0.5μL,10mmol·L-1F0.5μL,10mmol·L-1R0.5μL,Taq聚合酶0.2μL,模板1μL,加水至20μL。條件為94℃預(yù)變性3min,94℃30s、55℃30s、72℃1min,共30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸7min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳純化,克隆到pMD19-T載體上,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coliJM109,進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測(cè)獲得陽性克隆,測(cè)序由中美泰和公司完成。1.4nat-pcr法GenomeWalking法采用TaKaRa公司的GenomeWalkingKit,試驗(yàn)操作按照試劑盒說明書推薦方法進(jìn)行。應(yīng)用PrimerPremier5.0,根據(jù)已克隆的外顯子Ⅰ部分序列設(shè)計(jì)3條特異性上游步移引物sp1、sp2和sp3(表1)。以基因組DNA為模板進(jìn)行平PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為:dNTPMixture(2.5mmol·L-1each)8μL,10×LAPCRBufferII(Mg2+plus)5μL,TaKaRaLATaq(5U·μL-1)0.5μL,APPrimer1μL,SPPrimer1μL,模板1μL,加水至50μL。反應(yīng)條件為1stPCR:94℃1min;98℃1min;94℃30s,58℃1min,72℃2min,5個(gè)循環(huán);94℃30s,25℃3min,72℃2min;94℃30s,58℃1min,72℃2min,94℃30s,58℃1min,72℃2min,94℃30s,44℃1min,72℃2min,15個(gè)循環(huán);72℃10min。2nd和3rd:94℃30s,58℃1min,72℃2min,94℃30s,58℃1min,72℃2min,94℃30s,44℃1min,72℃2min,15個(gè)循環(huán);72℃10min。3次步移PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),分析目的片段。然后將第3步步移PCR產(chǎn)物電泳,目的片段膠回收純化。目的片段純化回收后克隆到pMD19-T載體上,轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliJM109,再進(jìn)過PCR反應(yīng)檢測(cè)得到陽性克隆,測(cè)序由中美泰和公司完成。1.5序列分析2結(jié)果與分析2.1-淀粉酶基因外顯子核苷酸序列及分析由于草魚α-淀粉酶基因編碼區(qū)序列未知,通過比較斑馬魚、胭脂魚、鱖、尖吻鱸和大西洋鮭α-淀粉酶基因外顯子Ⅰ序列,長(zhǎng)度為168bp,找到2段高度保守序列區(qū)域。在這2段區(qū)域中設(shè)計(jì)1對(duì)上下游引物(F和R),PCR得到1段90bp的草魚α-淀粉酶基因部分外顯子Ⅰ序列,電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1。另外,通過3次巢式PCR,克隆獲得了草魚α-淀粉酶基因外顯子Ⅰ另外一部分序列,長(zhǎng)度為78bp。將試驗(yàn)1.3和1.4獲得的兩部分外顯子Ⅰ序列進(jìn)行拼接,獲得草魚α-淀粉酶基因外顯子Ⅰ序列,長(zhǎng)度為168bp(圖2)。應(yīng)用Vector軟件,對(duì)草魚和斑馬魚、胭脂魚、日本鰻鱺、大西洋鮭、鱖、尖吻鱸、斜帶石斑魚、美洲鰈、重牙鯛(Diplodusannularis)的α-淀粉酶基因外顯子Ⅰ核酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。相似度分別為86%、83%、72%、68%、76%、77%、76%、74%和75%(表2)。2.2tss-pcr分析應(yīng)用GenomeWalking方法,經(jīng)過3輪步移PCR擴(kuò)增,從草魚基因組中克隆得到約2000bp的PCR條帶(圖3)。將該條帶回收、克隆、測(cè)序后得到2167bp的DNA片段。經(jīng)過分析,與草魚α-淀粉酶基因外顯子Ⅰ序列重疊部分為104bp,其余2063bp為5'側(cè)翼序列。分析獲得的序列發(fā)現(xiàn),序列兩端有1段是反向互補(bǔ)的,這段序列包括104bp的外顯子Ⅰ序列和266bp的側(cè)翼區(qū)域序列。將草魚α-淀粉酶基因5'側(cè)翼序列應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)啟動(dòng)子分析軟件進(jìn)行分析,找出1個(gè)潛在的啟動(dòng)子區(qū)域,位于-252bp至-2bp處。TSS位于起始密碼子上游30bp處,圖4中已標(biāo)出。在TSS上游30bp處有1個(gè)TATA-box,在-58bp和-1853bp處有CCAAT-box,在-162bp、-285bp、-427bp、-501bp、-625bp、-832bp、-1375bp、-1680bp、1747bp處有GATA元件,-43bp處有OCT-1元件,在-97bp、-1039bp、-1152bp、-1466bp、-1667bp、-1655bp處有GR元件,在-470bp處有FOXJ2元件,在-580bp和-667bp處有HNF-3元件,在-862bp處有AP-1元件,在-975bp、-1209bp和-1941bp處有SP-1元件,在-2001bp處有YY-1元件。各元件位點(diǎn)已在圖4中標(biāo)出。在線分析側(cè)翼序列中沒有發(fā)現(xiàn)有CpG島。2.3河蚊-淀粉酶基因5.2數(shù)據(jù)分析從NCBI數(shù)據(jù)庫中查找到了斑馬魚(BX510342)、尖吻鱸(AY442519)、鱖(EU908272)、河豚(AJ308233)α-淀粉酶基因5'側(cè)翼,其中河豚有3個(gè)α-淀粉酶基因重復(fù),使用MEGA5.2軟件進(jìn)行比較分析。采用Neighbor-Joining算法,以p-distance算法作為構(gòu)建進(jìn)化樹的模型,構(gòu)建距離進(jìn)化樹(圖5)。進(jìn)化樹結(jié)果顯示,河豚的3個(gè)α-淀粉酶基因5'側(cè)翼聚為一類,鱖和尖吻鱸聚為一類,草魚和斑馬魚聚為一類。結(jié)果說明草魚和斑馬魚α-淀粉酶基因的表達(dá)可能受到相似調(diào)控機(jī)制的調(diào)節(jié),鱖和尖吻鱸聚為一類,而且均為肉食性魚類,其α-淀粉酶基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制可能相似。2.4-淀粉酶基因5,apos酶切鑒定應(yīng)用DNAman軟件對(duì)草魚α-淀粉酶基因5'側(cè)翼序列進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析。篩選出了21種限制性內(nèi)切酶,共找到37個(gè)內(nèi)切酶位點(diǎn)(圖6)。AvrⅡ和MscⅠ/BalⅠ酶切可獲得TA-TA-box和OCT-1元件;AlwNⅠ和AvrⅡ酶切可分離CAAT元件;SphⅠ和MscⅠ/BalⅠ酶切可得到GATA-1、HNF-3、FOXJ2元件;SphⅠ和BstEⅡ酶切可得到Sp-1、AP-1和GR元件。草魚α-淀粉酶基因5'側(cè)翼的酶切位點(diǎn)信息為研究5'側(cè)翼不同區(qū)域的活性提供依據(jù),找出對(duì)α-淀粉酶基因表達(dá)起調(diào)控作用的調(diào)控元件,進(jìn)一步研究草魚α-淀粉酶基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制。3魚類-淀粉酶基因的結(jié)構(gòu)及與轉(zhuǎn)錄相關(guān)關(guān)系基因側(cè)翼序列的克隆技術(shù)有InversePCR、PanhandlePCR、VersatilePCR和Restriction-sitePCR等,但這些方法受到的限制因素較多,如步移范圍有限、酶切及連接反應(yīng)操作繁瑣等。該研究采用基于熱不對(duì)稱PCR的基因組步移技術(shù),通過3次巢式PCR反應(yīng)獲得側(cè)翼序列。該方法有高效、簡(jiǎn)便、特異性高等優(yōu)點(diǎn);可以有效獲取與已知序列相鄰的未知序列。由于草魚α-淀粉酶基因編碼區(qū)序列未知,該研究的一個(gè)難點(diǎn)在于引物的設(shè)計(jì)。比對(duì)已知幾種魚類α-淀粉酶基因外顯子Ⅰ序列,找到2段高度保守的序列作為模板設(shè)計(jì)引物,克隆獲得草魚α-淀粉酶基因外顯子Ⅰ序列。在此基礎(chǔ)上,在外顯子Ⅰ上設(shè)計(jì)3條特異性引物,通過基因組步移技術(shù)擴(kuò)增得到草魚α-淀粉酶基因5'側(cè)翼序列。該研究中獲得的草魚α-淀粉酶基因外顯子Ⅰ序列與已知魚類α-淀粉酶基因外顯子Ⅰ序列比對(duì)相似度為68%~86%,這與陳亮等研究鱖α-淀粉酶基因的結(jié)果相一致,可以確定得到序列屬于草魚α-淀粉酶基因。啟動(dòng)子是位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游的1段DNA序列,是RNA聚合酶識(shí)別并與模板DNA特異性結(jié)合的部位,保證轉(zhuǎn)錄起始的精確性。真核生物的啟動(dòng)子常含有TATA-box、GC-box和CAAT-box等作用元件,對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控有著重要作用。TATA盒和CCAAT盒保證了轉(zhuǎn)錄起始的精確性和頻率。該研究所得草魚α-淀粉酶基因5'側(cè)翼序列分析發(fā)現(xiàn)1個(gè)潛在的啟動(dòng)子區(qū)域,位于-252~-2bp處,TSS位于起始密碼子上游30bp處。該啟動(dòng)子區(qū)域包含有典型的TATA-box和CAAT-box,其TATA-box(5'-TATATAAA-3')位于-22~-29bp,符合真核生物啟動(dòng)子TATA-box序列模式以及與TSS的一般距離。CAAT-box位于-58bp,距離轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)較近,能夠增強(qiáng)淀粉酶基因轉(zhuǎn)錄效率。側(cè)翼序列中未發(fā)現(xiàn)有CpG島。在草魚α-淀粉酶基因5'側(cè)翼序列預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)中GATA-1出現(xiàn)的頻率最高,推測(cè)其在草魚α-淀粉酶基因的表達(dá)調(diào)控上具有重要作用。此外,草魚α-淀粉酶基因5'側(cè)翼序列中存在多個(gè)糖皮質(zhì)激素受體(GR)位點(diǎn)。糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)胰腺外分泌消化酶基因的表達(dá)。在鼠胰腺中糖皮質(zhì)激素增加淀粉酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶基因的表達(dá),并減少激肽釋放酶基因的表達(dá)。在尖吻鱸α-淀粉酶基因5'側(cè)翼序列中已鑒別出1個(gè)GRE元件,與人和鼠淀粉酶基因GRE元件在側(cè)翼序列上的位置不同。5種不同魚類的α-淀粉酶基因5'側(cè)翼序列的進(jìn)化樹分析表明,草魚和斑馬魚的進(jìn)化距離最近,可能具有相似的調(diào)控表達(dá)機(jī)制。但由于數(shù)據(jù)庫中關(guān)