gh基因多態(tài)性的pcr-sscp檢測(cè)與分析

gh基因多態(tài)性的pcr-sscp檢測(cè)與分析

采用聚合酶鏈反應(yīng)反應(yīng)單鏈結(jié)構(gòu)多態(tài)性分析（pcr-scp）方法，研究了牧場(chǎng)紅足基因（gh）遺傳多態(tài)性。為確定可用于標(biāo)記的分子標(biāo)記，并為中國優(yōu)質(zhì)特色牛提供理論基礎(chǔ)。1材料和方法1.1pcr擴(kuò)增劑草原紅牛68頭,來自吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,利用頸靜脈采血,ACD抗凝,-20℃保存,備用。TaqDNA聚合酶、dNTPs、蛋白酶K等試劑,購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司;pMD-18載體試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒,購自寶生物工程(大連)有限公司。1.2方法1.2.1na樣品溶液利用常規(guī)的苯酚/氯仿抽提方法提取基因組DNA,用TE溶液將DNA樣品稀釋,-20℃保存,備用。用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法雙重檢測(cè)DNA的純度和濃度,然后稀釋成30ng/μL,備用。1.2.2基因序列和引物試驗(yàn)所用GH引物是參照參考文獻(xiàn),并根據(jù)已發(fā)表的牛GH基因(accessionnumberM57764)的堿基序列設(shè)計(jì)的,6對(duì)引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列、PCR產(chǎn)物大小、位置見表1。1.2.3rtaq聚合酶活性反應(yīng)物體系共25.0μL,其中包括滅菌去離子水18.6μL,30.0ng/μL的DNA模板1.0μL,10×Buffer2.5μL,2.5mmol/L的dNTP1.0μL,10pmol/L的上下游引物各0.7μL,3U/μLrTaq聚合酶0.5μL。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù):94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,55～65℃復(fù)性40s,72℃延伸30～40s,35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min。1.2.4聚丙烯酰胺凝膠的tbe電泳2μLPCR產(chǎn)物加10μL變性上樣緩沖液,98℃變性10min后,立即冰浴10min,然后上樣置于預(yù)冷的聚丙烯酰胺凝膠上。試驗(yàn)根據(jù)擴(kuò)增片段的大小,將30%的聚丙烯酰胺凝膠(29∶1)配成8%～12%的聚丙烯酰胺凝膠,以160V電壓于1×TBE電泳14～18h。電泳結(jié)束以后,首先在70%乙醇中固定10～15min,用去離子水洗2次,每次2～3min;銀染30min(100mL染色液中含NH3·H2O1mL,0.36%NaOH21mL,20%AgNO31.8mL),再用去離子水洗3～4次,每次2～3min,加入顯色液(200mL顯色液中含1%檸檬酸鈉1mL,甲醛100μL),待電泳條帶清晰后換上去離子水停顯。1.2.5質(zhì)粒提取和測(cè)序進(jìn)行PCR-SSCP分析后,將不同純合子基因型個(gè)體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳分離、純化回收,回收后的DNA與pMD-18載體連接,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α菌株中,藍(lán)白斑篩選后經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定陽性克隆,提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行序列測(cè)定。2結(jié)果與分析2.1sscp分析對(duì)GH基因的內(nèi)含子3進(jìn)行擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠檢測(cè),獲得了與目的片段大小一致的產(chǎn)物(345bp),帶型清晰且無雜帶,穩(wěn)定性和特異性好(見圖1),可進(jìn)行SSCP分析。PCR產(chǎn)物經(jīng)SSCP分析結(jié)果表現(xiàn)出3種基因型(見圖2)。對(duì)P1RF的兩種純合基因型AA、BB克隆測(cè)序,并用DNASTAR比對(duì)分析,結(jié)果見圖3。結(jié)果表明,在1435bp處有一個(gè)T→C的突變(與GenBankaccessionM57764相比而得),導(dǎo)致等位基因A變?yōu)榈任换駼;在1692處有C→T的突變(與YaoJ等1996年的研究結(jié)果相同),但并未導(dǎo)致新的等位基因出現(xiàn)。2.2基因型的檢測(cè)由圖4可見,在8%的聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳條件下對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR-SSCP分析,在不同個(gè)體中檢測(cè)到了3種基因型(CC、CD、DD)。對(duì)P2RF的兩種純合基因型CC、DD克隆測(cè)序,發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)在1918處有C→A的突變(與GenBankaccessionM57764相比而得),導(dǎo)致等位基因C變?yōu)榈任换駾,序列比拼結(jié)果見圖5。2.3和2對(duì)等位基因控制利用30%的聚丙烯酰胺配制成濃度為12%凝膠,160V電壓電泳18h,結(jié)果表明,該位點(diǎn)由1對(duì)等位基因控制(E、F)。對(duì)PCR產(chǎn)物中的純合子基因型克隆測(cè)序,由序列比較結(jié)果(見圖7)可以看出:于GH基因外顯子5的2291bp處發(fā)生了1處堿基A→C突變。2.4gh和3gh基因基因型的分析在8%的聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)、160V電泳擴(kuò)增結(jié)果見圖9條件下進(jìn)行PCR-SSCP分析,結(jié)果表明,在不同個(gè)體中檢測(cè)到了3種基因型,見圖10。根據(jù)PCR-SSCP結(jié)果,將GG和HH兩種純合基因型進(jìn)行克隆測(cè)序,DNASTAR比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)在GH基因3′UTR位點(diǎn)2639處有C→G突變,導(dǎo)致等位基因由G變?yōu)镠,導(dǎo)致HaeⅢ增加一個(gè)酶切位點(diǎn);在2735bp處有T→C(與GenBankaccessionM57764相比而得)突變,但是并未導(dǎo)致新的等位基因出現(xiàn)。結(jié)果見圖11。2.5sscp分析對(duì)GH基因的5′UTR片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增(結(jié)果見圖12),經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠檢測(cè),獲得與目的片段大小一致的464bpPCR產(chǎn)物,帶型清晰且無雜帶。PCR產(chǎn)物經(jīng)SSCP分析結(jié)果表現(xiàn)出3種基因型(見圖13)。將P5RF位點(diǎn)的純合基因型II、JJ個(gè)體的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序,與DNASTAR比對(duì),結(jié)果見圖14。由結(jié)果分析可見,該片段在431處有一個(gè)A到G的突變,導(dǎo)致等位基因由I變?yōu)镴。2.6gh基因5utrpcr-scp分析結(jié)果利用P6RF引物對(duì)5′UTRPCR擴(kuò)增(結(jié)果見圖15)后,其產(chǎn)物進(jìn)行PCR-SSCP電泳分析,結(jié)果如圖16所示。3gh基因多態(tài)性生長激素是調(diào)節(jié)動(dòng)物生長發(fā)育和三大物質(zhì)代謝過程的一個(gè)重要內(nèi)分泌因子。bGH基因定位于19號(hào)染色體上,由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成,長約2856bp。國內(nèi)外研究報(bào)道證實(shí),GH基因遺傳多態(tài)性與牛的生長發(fā)育、屠宰和胴體性狀、泌乳和肉質(zhì)性狀有不同程度的相關(guān)性。試驗(yàn)以PCR-SSCP的方法,首次研究了基因全長在草原紅牛群體中的的遺傳多態(tài)性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在GH基因的第3內(nèi)含子、第4內(nèi)含子、第5外顯子的3′端和5′端存在豐富的等位基因突變。這與YaoJ等1996年的研究結(jié)果相同,但在草原紅牛群體中,并未導(dǎo)致新的等位基因出現(xiàn)。第4內(nèi)含子在1918bp處有C→A的突變,而YaoJ等的報(bào)道則是在2017bp處堿基T→C突變,高雪等報(bào)道,在1947bp處有T→G突變,該位點(diǎn)的突變需要進(jìn)一步探討。本試驗(yàn)中GH基因外顯子52291bp處有A→C突變,與YaoJ等報(bào)道的一致。研究對(duì)草原紅牛GH基因的全基因組序列進(jìn)行了多態(tài)性分析,發(fā)現(xiàn)了大量的突變位點(diǎn),