鎖陽多糖超聲提取工藝優(yōu)化及其含量測(cè)定

鎖陽多糖超聲提取工藝優(yōu)化及其含量測(cè)定

鎖陽，俗稱“老藥”，也被稱為羊咬不拉。這是鎖陽科多年生寄生草本植物的鎖陽。它通常生長在小麥科的白刺科上。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明,鎖陽多糖具有延緩衰老、抗疲勞、提高機(jī)體免疫力、抗應(yīng)激及抗糖尿病等作用。鎖陽的保健價(jià)值已被廣泛重視,出現(xiàn)了鎖陽咖啡、鎖陽糖、鎖陽沖劑等以鎖陽多糖為主要原料的食品、保健品、禮品及藥品等,具有很大的開發(fā)潛力。本實(shí)驗(yàn)采用單因素及正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)超聲輔助提取鎖陽多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)不同來源鎖陽樣品中多糖含量進(jìn)行測(cè)定,為鎖陽多糖的提取、含量測(cè)定以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1超純水的制備鎖陽瓜州億得生物科技有限公司提供,產(chǎn)地為甘肅省瓜州縣,經(jīng)鑒定為鎖陽科鎖陽屬植物鎖陽(CynomoriumsongaricumRupr.)的肉質(zhì)莖,樣品于50℃干燥恒重,粉碎,過100目篩,密封保存?zhèn)溆谩Ｆ咸烟翘旖蛑逻h(yuǎn);苯酚天津富宇;濃硫酸白銀銀環(huán);石油醚天津富宇等均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為超純水由純水儀制得。KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗儀昆山市超聲儀器有限公司;AB104-N電子天平Mettle-Toledo公司;CARY50ProbeUV-VisiblespectrophotometerVARIANAustraliaRTYLTD;Exceed-Da-20型艾柯純水儀成都康寧實(shí)驗(yàn)純水儀器廠。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1樣品溶液中葡萄糖含量的測(cè)定1.2.1.提取與除蛋白質(zhì)稱取干燥的鎖陽粉末100g,石油醚脫脂2次/1h,藥渣揮干溶劑后,80%乙醇回流提取2次/2h,藥渣揮干溶劑,加蒸餾水水浴回流提取3次/2h。過濾,合并3次提取液,濃縮至200mL左右,加0.1%活性炭,80℃水浴1h脫色,放冷后過濾。濾液中加95%乙醇,使含醇量達(dá)80%,靜置過夜,離心后將沉淀用蒸餾水溶解,按Sevag法(氯仿-正丁醇(4∶1))除蛋白質(zhì)。再將水液反復(fù)醇沉3次,離心后取沉淀,以無水乙醇、丙酮、乙醚多次洗滌,干燥后即得鎖陽粗多糖。1.2.1.葡萄糖對(duì)照溶液精密稱取105℃干燥至恒重的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖25mg,置250mL容量瓶中,加蒸餾水溶解并定容至刻度,得0.1mg/mL的葡萄糖對(duì)照溶液。1.2.1.3.試溶液的制備精密稱取鎖陽粗多糖100mg,加水溶解并定容至50mL,得供試品溶液備用。1.2.1.%苯酚法精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各1.0mL于具塞試管中,加蒸餾水1.0mL。另取2.0mL蒸餾水作為空白。每一試管中加入1.0mL5%苯酚溶液,混勻,迅速加入5.0mL濃硫酸,搖勻,放置10min,置40℃水浴保溫15min,取出后迅速冷卻至室溫。于400~700nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,結(jié)果表明葡萄糖對(duì)照品與鎖陽多糖在490nm處均有特征吸收,故選490nm作為測(cè)定波長。1.2.1.加蒸餾時(shí)間的確定精密移取葡萄糖對(duì)照液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL,依次加蒸餾水使最終體積為2.0mL,另取2.0mL蒸餾水作為空白。同“測(cè)定波長的選擇”項(xiàng)下方法操作,于490nm處測(cè)定吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo),葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制曲線。1.2.1.鎖陽多糖得率的測(cè)定精密稱取鎖陽樣品粉末1.0000g,6倍體積石油醚回流脫脂2次/2h,藥渣揮干石油醚后,以6倍體積80%乙醇回流提取2次/2h。藥渣揮干溶劑后以蒸餾水為提取溶劑,按不同的超聲功率、料液比、提取溫度、超聲提取時(shí)間、提取次數(shù)制得鎖陽多糖提取液,冷卻后,加水定容于100mL容量瓶中,搖勻,得鎖陽供試品溶液。稀釋至合適濃度后吸取2.0mL于具塞試管中,按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)下操作,測(cè)定供試品溶液的吸光度值,并按下式計(jì)算多糖得率。式中:C為供試液中葡萄糖濃度(mg/mL);V為稀釋后供試液總體積(mL);m為供試品重量(mg)。1.2.2單因素研究選擇超聲功率、料液比、提取溫度、超聲提取時(shí)間及提取次數(shù)為因素,考察各因素對(duì)鎖陽多糖得率的影響。1.2.2.超聲功率對(duì)鎖陽多糖得率的影響精密稱取鎖陽粉末1.0000g,超聲功率分別設(shè)定為240、360、480、600W(不同超聲功率做3個(gè)平行),以料液比1∶30,提取溫度80℃,超聲時(shí)間70min,提取2次,考察超聲功率對(duì)鎖陽多糖得率的影響。1.2.2.料液比對(duì)鎖陽多糖得率的影響精密稱取鎖陽粉末1.0000g,在以上因素篩選結(jié)果的基礎(chǔ)上,料液比分別設(shè)定為1∶6、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(不同料液比做3個(gè)平行),提取溫度80℃,提取時(shí)間70min,提取2次,考察料液比對(duì)鎖陽多糖得率的影響。1.2.2.提取溫度對(duì)鎖陽多糖得率的影響試驗(yàn)精密稱取鎖陽粉末1.0000g,在以上因素篩選結(jié)果的基礎(chǔ)上,提取溫度分別設(shè)為60、70、80、90℃(不同溫度做3個(gè)平行),提取時(shí)間70min,提取2次,考察提取溫度對(duì)鎖陽多糖得率的影響。1.2.2.超聲提取時(shí)間對(duì)鎖陽多糖得率的影響精密稱取鎖陽粉末1.0000g,在以上因素篩選結(jié)果的基礎(chǔ)上,提取時(shí)間分別設(shè)定為30、50、70、90min(不同時(shí)間做3個(gè)平行),提取2次,考察超聲提取時(shí)間對(duì)鎖陽多糖得率的影響。1.2.2.提取次數(shù)對(duì)鎖陽多糖得率的影響精密稱取鎖陽粉末1.0000g,在以上因素篩選結(jié)果的基礎(chǔ)上,提取次數(shù)分別設(shè)定為1、2、3、4次(不同提取次數(shù)做3個(gè)平行),考察提取次數(shù)對(duì)鎖陽多糖得率的影響。1.2.3鎖陽中多糖提取工藝的正交實(shí)驗(yàn)綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,設(shè)計(jì)4因素3水平(L9(34))正交實(shí)驗(yàn)對(duì)鎖陽中多糖超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,并利用SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的因素水平表見表1。1.2.4方法研究1.2.4.1.精細(xì)試驗(yàn)精密吸取一定量對(duì)照品溶液,按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)下方法測(cè)定其吸光度,連續(xù)測(cè)定6次。1.2.4.2重復(fù)試驗(yàn)1.2.4.對(duì)照品溶液和樣品溶液吸收劑用量的測(cè)定精密吸取在放置0、2、4、6、8h后的對(duì)照品溶液和樣品溶液各1.0mL置具塞試管中,按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)下操作,測(cè)定其吸光度。1.2.4.加樣回收率及rsd值的測(cè)定精密稱取9份同一批已知含量的鎖陽樣品,分別精密加入一定量的對(duì)照品,同時(shí)制取9份提取液,按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”的方法測(cè)其吸光度值,計(jì)算回收率及RSD值。1.2.5鎖陽供試品溶液的制備精密稱取各批次鎖陽粉末1.0000g置于100mL圓底燒瓶中,按照最優(yōu)工藝,制得的鎖陽提取液,冷卻后,加水定容于100mL容量瓶中,搖勻,得鎖陽供試品溶液。稀釋至合適濃度后吸取2.0mL于具塞試管中,按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)下的操作,測(cè)定供試品溶液的吸光度,按得率公式計(jì)算樣品中多糖含量。2結(jié)果與分析2.1葡萄糖溶液線性范圍根據(jù)“標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)下方法,測(cè)得回歸曲線方程:Y=12.6308X-0.0144(r=0.9997),表明葡萄糖溶液在0.01~0.09mg/mL濃度范圍內(nèi),線性關(guān)系良好(實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如圖1所示)。2.2單因素研究和結(jié)果2.2.1超聲功率對(duì)多糖得率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示,超聲功率從240W增大到480W時(shí),多糖得率隨之增大,并在480W時(shí)達(dá)最大值,當(dāng)超聲功率繼續(xù)增大,得率下降,故選擇超聲功率為480W。2.2.2不同時(shí)間點(diǎn)多糖得率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示,料液比從1∶6增加到1∶30的過程中,多糖得率逐漸增大,至1∶30時(shí)達(dá)最大值。隨后繼續(xù)增大料液比,得率下降,故選擇提取料液比為1∶30。2.2.3提取溫度對(duì)多糖得率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示,溫度從60℃升高到80℃過程中,多糖得率隨提取溫度的升高逐漸增大,80℃時(shí)達(dá)最大值。而后隨溫度繼續(xù)增大,得率下降,故選定提取溫度為80℃。2.2.4超聲提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示,超聲提取時(shí)間從30min增加至70min的過程中,多糖得率逐漸增大,且在70min時(shí)達(dá)最大值,而后減小,故選擇超聲提取時(shí)間為70min。2.2.5提取時(shí)間對(duì)得率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示,提取次數(shù)從1次到2次,得率增大幅度較明顯,再增加提取次數(shù),得率沒有明顯的提高,故選定提取次數(shù)為2次。2.3鎖陽多糖得率正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素篩選結(jié)果基礎(chǔ)上,為進(jìn)一步考察各因素之間的相互影響,選擇超聲功率(A)、料液比(B)、提取溫度(C)和超聲提取時(shí)間(D)為考察因素,以多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo),設(shè)計(jì)了4因素3水平(L9(34))正交實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2;方差分析結(jié)果見表3。正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,各因素對(duì)鎖陽多糖得率影響次序?yàn)?提取溫度>超聲功率>料液比>超聲時(shí)間。得到最佳條件為A1B3C2D1,即超聲功率為420W,料液比為1∶35,提取溫度為80℃,提取時(shí)間為60min。2.4最佳配方的驗(yàn)證按正交實(shí)驗(yàn)確定的最佳提取條件并在提取2次情況下,測(cè)得多糖含量為4.51%(n=5,RSD=1.98%),比正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的較優(yōu)組4.37%得率高,表明此正交實(shí)驗(yàn)得出的最優(yōu)組合準(zhǔn)確可行。2.5研究方法的結(jié)果2.5.1精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示,6次連續(xù)測(cè)定吸光度值的RSD=0.10%,表明儀器精密度良好,測(cè)定結(jié)果可靠。2.5.2重復(fù)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示,多糖含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.98%,表明本方法重復(fù)性良好。2.5.3穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)2.5.4相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7所示,加樣回收率在95.81%~104.20%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=3.03%(n=9),表明該方法簡便、快速、準(zhǔn)確,靈敏度高,可用于鎖陽多糖的含量測(cè)定。2.6瓜州鎖陽多糖含量的變化根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)得出的最佳提取工藝,提取并測(cè)定不同來源的鎖陽樣品多糖含量,結(jié)果如表8:實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,瓜州鎖陽除2009年5月采摘的002號(hào)樣外,其余樣品的多糖含量明顯高于內(nèi)蒙和新疆樣品,這可能與其當(dāng)年的生長環(huán)境的土壤營養(yǎng)、水分、氣候等因素有關(guān)。瓜州鎖陽中,又以三九鎖陽多糖含量最高;不同生產(chǎn)年限鎖陽中,多糖含量也有一定的差異。3超聲提取鎖陽多糖的最佳條件近年來,使用超聲提取鎖陽多糖的研究較少,且均未對(duì)超聲功率進(jìn)行篩選研究。本研究結(jié)果表明,超聲功率對(duì)鎖陽多糖得率影響顯著,并且得到的超聲提取工藝能明顯提高鎖陽多糖的得率。本研究通過單因素及正交實(shí)驗(yàn)的系統(tǒng)篩選研究結(jié)果表明,各影響因素中,提取溫度和超聲功率對(duì)鎖陽總多糖得率影響顯著,而料液比和超聲時(shí)間的影響較小。得到超聲提取鎖陽多糖的最佳條件為:超聲功率為420W,料液比為1∶35,提取溫度為80℃,提取時(shí)間為60min。且通過精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此方法操作簡便、靈敏度高,適合鎖陽樣品中多糖含量的測(cè)定。對(duì)不同來源鎖陽樣品中多糖含量測(cè)定結(jié)果表明,瓜州鎖陽樣品中多糖含量較新疆和內(nèi)蒙兩地的高,而瓜州樣品中又以三九鎖陽多糖含量最高,這與“瓜州鎖陽甲天下”和