鎖陽多糖對衰老模型小鼠免疫功能的影響

鎖陽多糖對衰老模型小鼠免疫功能的影響

鎖陽是鎖定科的一種多年生草本植物，通常寄生在系列科的白刺植物根部。在我國西部有豐富的鎖陽資源,內(nèi)蒙古是其主產(chǎn)地之一。鎖陽性甘、溫,有補(bǔ)腎壯陽、益精血,潤腸通便等功效?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)鎖陽有清除氧自由基、抗氧化、抗缺氧、抗應(yīng)激、抗疲勞、抗癌、抗HIV以及潤腸通便等作用。本課題組在以前的工作中也發(fā)現(xiàn)以多糖為主要成分的鎖陽水提物有對衰老小鼠的抗氧化作用。鎖陽多糖(CynomoriumsongaricumPolysaccharide,CSP)為鎖陽的主要活性成分之一。本實(shí)驗(yàn)主要研究鎖陽多糖的抗衰老的免疫機(jī)制及對衰老小鼠睪丸組織端粒酶的影響。1材料表面1.1酶聯(lián)免疫檢測儀器UV-2450型可見分光光度計(Shimadzu公司);RID-2A示差折光檢測器、LC-6A液相色譜儀(日本島津公司);DG3022-A型酶聯(lián)免疫檢測儀(華東電子管廠);D-半乳糖、PHA-P(Sigma公司,批號P8090)、MTT(Sigma公司);胎牛血清(MDGenics公司,批號051803);1640(Cibco公司,批號60P52);小鼠端粒酶TEELISA試劑盒(RPBio公司,批號20060408);自配Hanks液,雞紅細(xì)胞懸液;試劑均為分析純。1.2獨(dú)貴基于自然生物的化合物鑒定2006年5月采于內(nèi)蒙古鄂爾多斯市杭錦旗獨(dú)貴特拉鎮(zhèn),經(jīng)內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物系陳貴林教授鑒定。新鮮鎖陽除去花序,自然干燥,粉碎,過5號篩,置于硅膠干燥器中備用。1.3csp的制備取鎖陽粉末,加95%乙醇浸泡脫脂,離心取沉淀,按料液比1∶15加水,94℃下水浴提取2h,重復(fù)提取2次。上清液加95%乙醇使含醇量達(dá)到80%以上,放置24h后離心,沉淀用丙酮、無水乙醇、90%乙醇各洗滌2次得粗多糖。粗多糖加水復(fù)溶,過濾除去沉淀,以5%三氯醋酸、Sevag法去蛋白各2次,再次醇沉,沉淀重新溶解于水,在纖維素透析袋中用去離子水透析3d后醇沉,沉淀經(jīng)無水乙醇至80%乙醇分級醇洗,真空干燥至恒重,得鎖陽多糖(CSP),CSP得率為1.24%。將所得CSP加水溶解,以苯酚-硫酸法測得多糖含量為93.2%。經(jīng)紫外光譜測定,在260nm無吸收,280nm有小吸收峰,說明CSP樣品不含核酸類物質(zhì),含少量蛋白雜質(zhì)。精制的CSP經(jīng)凝膠高效液相色譜測其平均分子質(zhì)量為1.29×105。1.4csp的給藥、劑量及劑量昆明種小鼠,清潔級(體質(zhì)量18~22g,♀♂各半,內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,合格證號:SCXK(蒙)2002-0001;小鼠隨機(jī)分為5組:正常組、衰老模型組、CSP低、中、高劑量用藥組,每組20只,♀♂各半。模型組及給藥組每日腹腔注射50g·L-1D-半乳糖10mL·kg-1·d-1,正常組給同劑量生理鹽水。CSP低、中、高劑量組每日灌胃CSP,劑量分別為20,40,80mg·kg-1·d-1(低劑量約為鎖陽飲片臨床用藥劑量換算為所含多糖的2倍),空白組和模型組以等量純化水灌胃。連續(xù)給藥56d。各組隨機(jī)取一半動物測定淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率;另一半測定腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率,然后拔眼球放血,頸椎脫臼致死,取胸腺及脾臟稱重測定臟器指數(shù),無菌取雙側(cè)股骨骨髓,測定骨髓細(xì)胞增殖數(shù)。2方法2.1體內(nèi)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束后各組動物末次給藥后1h,肌注2g·L-1植物血凝素(PHA-P)0.2mL體內(nèi)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化,連續(xù)3d后,剪尾取血,涂片,吉姆薩染色,檢查淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況。以核仁疏松,染色質(zhì)變淺,漿液增多判斷為轉(zhuǎn)化細(xì)胞,每片計數(shù)100個,計算轉(zhuǎn)化率。2.2動物紅細(xì)胞一、三、三、三、三、三、三、三、三、三、三、4.2不同大小雞紅細(xì)胞一、4.5%雞紅細(xì)胞一、5.2單次給藥后7h的清皮色,5.2個紅細(xì)胞的邏輯應(yīng)用程序?qū)嶒?yàn)周期結(jié)束后各組動物末次給藥后12h,腹腔注射6%淀粉肉湯1mL,誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞功能,24h后腹腔注射0.5%雞紅細(xì)胞懸液1mL,30min后處死動物,經(jīng)腹腔注入Hanks液3mL,輕揉腹部,吸出腹腔稀液2mL,1500r·min-1離心10min,棄上清,用沉淀涂片,吉姆薩染色,油鏡觀察,計數(shù)100個巨噬細(xì)胞,計算吞噬百分率。2.3mtt吸收劑用量測定在無菌條件下取小鼠雙側(cè)股骨上段,用Hanks液沖洗后,剪開兩端,1640沖洗出骨髓細(xì)胞,1000r·min-1下離心10min,棄上清,用1640調(diào)細(xì)胞密度至5×106·mL-1,取100μL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,設(shè)2個復(fù)孔,置37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h,終止前4h加入MTT(5mg·mL-1)20μL,終止培養(yǎng)時,每孔加100μLDMSO,振蕩5min,于酶標(biāo)儀在波長490nm處測定其吸光度值。以D值代表小鼠骨髓細(xì)胞增殖能力。2.4處理數(shù)據(jù)采用單因素方差分析比較各試驗(yàn)組間的差異。2.5陽性率的測定各組雄性小鼠處死后立即取雙側(cè)睪丸,分別裝凍存管液氮保存,取出后低溫下迅速研成勻漿,按試劑盒規(guī)定程序檢測,以樣品450nm下讀D值,樣品測定值高于對照孔的為陽性,計算各組陽性率。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。3結(jié)果3.1兩組動物體質(zhì)量及臟器指數(shù)比較連續(xù)給藥8周后,發(fā)現(xiàn)各給藥組與正常組小鼠外觀和行為表現(xiàn)無明顯變化。體質(zhì)量測定發(fā)現(xiàn)各組動物體質(zhì)量差異無顯著性(P>0.05)。胸腺及脾臟臟器指數(shù)見表1,D-半乳糖衰老模型組臟器指數(shù)略低,給藥組臟器指數(shù)均有不同程度提高,但各組數(shù)據(jù)差異無顯著性(P>0.05)。說明D-半乳糖衰老模型組和各給藥組小鼠在體質(zhì)量和免疫器官的生長中變化不明顯。3.2不同給藥劑量對小鼠骨髓細(xì)胞增殖能力的影響如表2所示,D-半乳糖衰老模型組小鼠骨髓細(xì)胞增殖數(shù)較正常組明顯降低(P<0.01),降幅達(dá)25%,給藥后,高、中、低劑量CSP均能顯著逆轉(zhuǎn)骨髓細(xì)胞減少的趨勢,同模型組相比差異有極顯著性(P<0.01),使骨髓細(xì)胞增殖數(shù)接近或高于正常組,說明CSP能明顯提高衰老小鼠骨髓細(xì)胞增殖能力。D-半乳糖衰老模型組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率顯著降低(P<0.01),給藥后各劑量組均高于模型組,其中高劑量組同模型組相比淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(P<0.01)和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率(P<0.05)差異有極顯著性,低劑量組和中劑量組與衰老模型組的差異顯著。說明CSP對衰老小鼠降低的非特異性免疫功能有一定的提高作用,但此作用在高劑量下明顯,劑量較低時不能糾正衰老引起的非特異性免疫功能下降。3.3csp對成熟大鼠睪丸組織末端脂酶的影響由表3可知,CSP中、高劑量組小鼠睪丸組織端粒酶陽性率明顯高于衰老模型組,高劑量組及中劑量組陽性率接近正常組。4糖對慢性酒精性小鼠骨髓細(xì)胞增殖和抗氧化能力的影響CSP在分級醇沉?xí)r以90%乙醇得率最高,但多糖純度較低,以80%乙醇醇沉?xí)r多糖得率和含量均較高,因此本實(shí)驗(yàn)在多糖精制時采用80%醇沉。D-半乳糖致衰老模型是利用D-半乳糖是一種二醛糖,在醛糖還原酶作用下被還原成半乳糖醇后,不能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝,而堆積在細(xì)胞內(nèi),引起氧化應(yīng)激、自由基損傷及誘導(dǎo)醛糖還原酶活性增強(qiáng)等一系列病理生理變化,使細(xì)胞腫脹、代謝紊亂,引發(fā)衰老。本實(shí)驗(yàn)采用D-半乳糖制作小鼠衰老模型,發(fā)現(xiàn)D-半乳糖能明顯降低骨髓細(xì)胞的增殖能力,引起非特異性免疫功能降低,進(jìn)一步說明了用D-半乳糖造衰老模型的方法是可行的。目前還未見對CSP的抗衰老免疫機(jī)制研究的報道,實(shí)驗(yàn)中可見CSP對衰老小鼠體質(zhì)量及免疫器官臟器指數(shù)無明顯影響,但能夠顯著提高衰老小鼠的骨髓細(xì)胞增殖數(shù),高劑量也能增強(qiáng)非特異性免疫功能,證明其有增強(qiáng)免疫功能、抗衰老的作用,而且CSP抗衰老作用在祖細(xì)胞水平更加明顯,較低劑量下即可起到。端粒是真核細(xì)胞染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu),由端粒DNA和端粒蛋白質(zhì)組成。端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶,可以以自身RNA為模板合成端粒,在端粒上添加串聯(lián)重復(fù)的端粒序列來平衡端粒的損失以完成染色體的完全復(fù)制。端粒酶在正常細(xì)胞不表達(dá),只在生殖細(xì)胞、干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),CSP可以提高衰老小鼠的端粒酶活性,說明其有可能通過抑制端粒的縮短進(jìn)程,延緩細(xì)胞凋亡而起到抗衰老作用。本實(shí)驗(yàn)采用Elisa法